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普通PCR和熒光定量PCR的引物設計方面對比
閱讀：675 發(fā)布時間：2024-1-29 引物，在核苷酸聚合作用的起始時，可以刺激合成另一種大分子，并與反應物以共價鍵形式連接的序列。在核酸化學中，引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結合在核酸鏈上與之互補的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，核酸聚合酶可由其3′端開始合成新的核酸鏈。無論是做普通PCR還是熒光定量(Real time)PCR，設計合適的引物是非常關鍵的一步。
普通PCR和熒光定量PCR的檢測方式具有較大的差別。熒光定量PCR實時監(jiān)測與DNA結合的熒光染料激發(fā)的熒光，普通PCR通過檢測插入DNA中核酸染料的量來測定PCR最終產(chǎn)物量。熒光定量PCR可以通過擴增曲線進行精確定量，普通PCR則是通過電泳的方式進行定性分析。那么在普通PCR和熒光定量PCR的引物設計方面，有什么相同和不同處呢？
相同處：
1、序列的查找是一致的；
2、序列選取應在基因的保守區(qū)段；
3、選取合適的擴增片段大小
4、避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；
5、避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結構；
6、Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；
7、引物之間的TM相差避免超過2℃；
8、引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基；
不同處：
Real time PCR 引物
1、PCR 產(chǎn)物長度；real-time PCR要求在300bp以內，一般選80-150bp 之間；
2、多對目的基因同時擴增，文獻上查來的引物條件會不同，需要設計盡可能條件一致的引物；
3、目的基因含量比較低時，需要設計靈敏度比較高的引物；
4、相對電泳法，Real time PCR靈敏度比較高，對引物的要求更高，引物二聚體要少；熔解曲線要求單一產(chǎn)物；
5、Real time PCR的目的是進行定量或者相對定量，對擴增的效率有要求；對引物的二級結構要求高；
普通PCR 引物：
1、根據(jù)實驗的要求不同，長度一般是從150bp到幾千bp 不等；
2、對二級結構要求沒有real time PCR 高；
3、對擴增效率要求不高；
4、可以選用梯度PCR 儀，選擇不同退火溫度，對引物退火溫度要求不需要一致；
驗證時不同：
引物的特異性（相同點）：
引物的特異性在使用前用blast 來保證；
不同點：real time PCR
在實驗結果中通過熔解曲線來驗證；
PCR的特異性產(chǎn)物峰應與引物報告中的PCR product 相差在兩度之內；
普通PCR 通過產(chǎn)物的長度，跑條帶，來鑒別產(chǎn)物的特異性；
Real time PCR 可以通過擴增曲線，熔解曲線分析來鑒別產(chǎn)物的相對量，同時也可以對終產(chǎn)物進行電泳分析，更全面，更科學！