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技術(shù)文章

提取到質(zhì)量良好的RNA方法技術(shù)

閱讀:456          發(fā)布時(shí)間:2022-8-8

      提取到質(zhì)量良好的RNA(包括總RNA和mRNA,以下同),概括起來(lái)有兩種方法,總結(jié)如下:
1、檢測(cè)RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景(溶液渾濁度)、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。一般的,我們只看OD260/OD280(Ratio,R)。
1.82.0時(shí),我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的,不過(guò)要注意,當(dāng)你用Tris作為緩沖液檢測(cè)吸光度時(shí),R值可能會(huì)大于2(一般應(yīng)該是<2.2的)。當(dāng)R<1.8時(shí),溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯,你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運(yùn)。當(dāng)R>2.2時(shí),說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。
如果RNA的量夠,可在260nm(A260)用分光光度法測(cè)定RNA的得率,1個(gè)單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度,其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇?xì)埩?,其值大?.4,需用乙酸鹽,乙醇沉淀RNA。
2、RNA的電泳圖譜
一般的,RNA的電泳都是用變性膠進(jìn)行的,但是根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn),如果你僅僅是為了檢測(cè)RNA的質(zhì)量是沒(méi)有必要進(jìn)行如此麻煩的實(shí)驗(yàn)的,用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和他們的比值,或者是mRNA smear的完整性。一般的,如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰),并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上,我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的。
以上是我們常用的兩種方法,但是這兩種方法都無(wú)法明確的告訴我們RNA溶液中有沒(méi)有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶,用以上方法我們很難察覺(jué),但是大部分后續(xù)的酶學(xué)反應(yīng)都是在37度以上并且是長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行的。這樣,如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶,那么在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中就會(huì)有非常適合的環(huán)境和時(shí)間發(fā)揮它們的作用了,當(dāng)然這時(shí)你的實(shí)驗(yàn)也就完了。



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