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上海禾工科學(xué)儀器有限公司

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反相液相色譜法測定人血漿中格列吡嗪濃度

閱讀:1893      發(fā)布時間:2009-10-19
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 [摘要] 目的 建立反相液相色譜法測定人血漿中格列吡嗪濃度的方法。
          方法:格列吡嗪血漿樣品在酸性條件下以二氯甲烷-正己烷(50:50)提取,以格列齊特為內(nèi)標(biāo):色譜柱:Nova-pak C18柱(4.6mm×250mm,4μm);流動相:甲醇-0.03mol/L。磷酸二氫鉀(pH值=3.0)(59:41);流速:O.8 mL/min;檢測波長:228nm。結(jié)果:標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍20~1000μg/L;回歸方程:Y=0.0034X一0.512,r=0.9992,血漿中格列吡嗪zui低檢測限為15μg/L。平均提取回收率為(86.8±5.7)%,平均回收率為(104.3±4.3)%,日內(nèi)RSD≤2.9%,日間RSD≤4.9%。結(jié)論:該方法具有良好的準(zhǔn)確性、精密性和較高的靈敏度,適用于格列吡嗪的藥動學(xué)研究和治療監(jiān)測。

【關(guān)鍵詞】格列吡嗪;血藥濃度;反相液相色譜法
         建立人血漿格列吡嗪含量測定方法,對服用格列吡嗪的患者進(jìn)行藥動學(xué)研究,對于指導(dǎo)患者合理用藥、減少不良反應(yīng)的發(fā)生有一定的臨床意義。筆者建立了安全可靠、準(zhǔn)確、靈敏的測定人血漿中格列吡嗪的反相液相色譜(RP-HPLC)法,適用于人體內(nèi)格列吡嗪藥動學(xué)研究。 

        1 儀器與試劑
         1.1 儀器Waters液相色譜儀:5l5泵;996二極管陣列檢測器;Rheodyne 7725i進(jìn)樣器;2010Millenium色譜管理系統(tǒng)(美國Waters公司);DZF-3型真空干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠);XW-80A漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。
         1.2 試劑 格列吡嗪對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:960804),格列齊特原料(廣東省藥品檢驗(yàn)所);空白血漿(廣州市血液中心);甲醇(色譜純,天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司);二氯甲烷、正己烷、磷酸二氫鉀均為分析純。

        2 方法與結(jié)果 
        2.1 色譜條件分析柱:美國Waters Nova-pak Cl8柱(4.6mmx 250mm,4μm);流動相:甲醇-0.03mol/L。磷酸二氫鉀(pH值=3.0)(59 :41);流速:0.8mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:228nm;進(jìn)樣量:10μL。
         2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取格列齊特原料適量置于50mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,制成300mg/L。的內(nèi)標(biāo)儲備液。精密量取內(nèi)標(biāo)儲備液1.0mL置于50mL容量瓶中,用甲醇配成濃度為6mg/L 的內(nèi)標(biāo)溶液。
        2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取格列吡嗪對照品適量置于100mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,制成100 mg/L。儲備液。分別精密量取格列吡嗪儲備液1.0mL置于50mL容量瓶中,2.0mL置于25mL容量瓶中,用甲醇配成濃度分別為2.8mg/L的格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液。
        2.4 洋品處理 取1.0mL人血漿樣品,精密加入50μL內(nèi)標(biāo)溶液和100μL鹽酸溶液(2.0mol/L),混合均勻,加入3.0mL二氯甲烷-正己烷(50:50)置于漩渦混合器上混合5min。離心5min(6000r/min)。取有機(jī)相置于另一試管中。水相用同法重復(fù)提取2次,合并有機(jī)相,置于40℃真空干燥箱中干燥。殘渣用50μL甲醇-純化水(59:41)溶解,l0μL進(jìn)樣。
        2.5色譜行為在上述色譜條件下,格列吡嗪、內(nèi)標(biāo)峰形對稱并與內(nèi)源性雜質(zhì)分離良好?格列吡嗪保留時間為l0.7 min,內(nèi)標(biāo)保留時間為l3.8min。格列吡嗪甲醇溶液、人空白血漿和血漿樣品色譜圖。
        2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 于空白血漿中加入不同濃度的格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,使藥物濃度分別為20,50,100,200,500,l000μg/L,按前述方法提取、測定。以格列吡嗪與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比(以吸收度之比表示)對格列吡嗪血漿濃度(C)進(jìn)行線性回歸。格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0034C一0.0512,r=0.9992。格列吡嗪血漿樣品在20~1000μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
        2.7 回收率試驗(yàn) 于空白血漿中加入適量格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液,得50,200,500μg/L 3種濃度的質(zhì)控血漿,按前述方法提取、測定。以1d內(nèi)5次測得的格列吡嗪濃度計算方法回收率,并以其峰面積與相應(yīng)濃度未經(jīng)提取的格列吡嗪甲醇溶液直接進(jìn)樣所得峰面積的比值計算提取回收率。3種質(zhì)控血漿的平均提取回收率為(86.8±5.7)%,平均方法回收率為(104.3±4.3)%,日內(nèi)RSD≤2.9%,日間RSD≤4.9%。
        2.8 精密度試驗(yàn) 按“回收率試驗(yàn)”項下方法配制格列吡嗪質(zhì)控血漿,提取后測定。以1d內(nèi)5次測定的格列吡嗪濃度計算日內(nèi)精密度。另于5d內(nèi)取上述格列吡嗪質(zhì)控血漿每天各測定1次,計算13間精密度。
         2.9 zui低檢測 限于空白血漿中加入適量格列吡嗪工作溶液,制得濃度<20μg/L并逐漸降低的一組樣品。對每個濃度的樣品進(jìn)行提取、測定,以能達(dá)到S/N=3時樣品的zui低濃度為zui低檢測限。格列吡嗪zui低檢測限為l5μg/L。

         3 討論
        目前國內(nèi)文獻(xiàn)報道大多使用乙醚提取血漿中格列吡嗪 。乙醚雖然容易揮干,但使用前需要重蒸,操作繁瑣且不安全。筆者采用毒性較小的二氯甲烷-正己烷(50:50)作為提取溶劑,操作簡便、安全可靠,更適于推廣應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)lmL血漿中加入5mL二氯甲烷.正己烷(50:50)提取格列吡嗪容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn),血漿樣品與提取溶劑體積比為l:3可避免產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。為了使之提取*,筆者對血漿樣品進(jìn)行3次提取,結(jié)果顯示本法的提取回收率與固相萃取法(SPE)接近,兩者均>80%。
        本實(shí)驗(yàn)流動相pH值為3.0,較文獻(xiàn)報道為低,使格列吡嗪峰形得到了改善,提高了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。


[參考文獻(xiàn)]
[1] 江志強(qiáng),張奇志,蔣新國,等.格列吡嗪2種片劑的藥動學(xué)和人體生物利用度比較[J].中國新藥與臨床雜志,2000,19(5):381—384.
 

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