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IL-17的檢測(cè)

2012-5-5  閱讀(407)

IL-17是新近被確認(rèn)的一種細(xì)胞因子,由T細(xì)胞,主要是CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生,其靶細(xì)胞廣泛??杉せ钷D(zhuǎn)錄因子NF-KB,誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、ID8、GM-CSF、和膜性細(xì)胞間粘附分子1(1CAM-1),促進(jìn)由亞適劑量PHA所誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。目前編碼IL-17及其受體的基因核苷酸序列已被部分測(cè)定。

(1)IL-17的誘導(dǎo):取人PBMC或純化的CD4+T細(xì)胞,加入誘導(dǎo)劑(PMA 5ng/mL+ionomycin 3ug/mL,或ConA 63ug/mL,或抗CD28抗體+CD3抗體),37℃孵育48—72h。收集培養(yǎng)上清液檢測(cè)IL-17含量(ELISA法)或生物學(xué)活性。

(2)IL-17生物學(xué)活性檢測(cè):通過誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞或腎癌上皮細(xì)胞株(TUMT或CHA)產(chǎn)生IL-6、IL-8或GM-CSF可以檢測(cè)IL-17的活性。

1)滑膜細(xì)胞的制備:外科切取關(guān)節(jié)滑膜,剪碎后用4ug/mL膠原酶消化,37~C孵育2~3h,單個(gè)細(xì)胞懸液用培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后,洗去未粘附細(xì)胞。待細(xì)胞生長至匯合,用胰蛋白酶消化傳代。一般采用3—8代的滑膜成纖維樣細(xì)胞作為檢測(cè)用靶細(xì)胞。

2)取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔依次加人104滑膜細(xì)胞或是TUMT細(xì)胞(或CHA細(xì)胞),不同稀釋度的IL-17待測(cè)樣品,總體積為200uL,置370(2 5%C02溫箱中孵育48h,收集上清,置-20℃保存以備檢測(cè)細(xì)胞因子活性。用ELISA法或生物學(xué)活性測(cè)定法檢測(cè)上清液中的II-6、IL-8或GM-CSF等細(xì)胞因子的含量或活性,以此推測(cè)IL-17的活性。



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