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上海源葉生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： S30260異硫氰酸胍,30259鹽酸胍,嗜熱菌蛋白酶 |
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3H-TdR摻入法檢測IL-2的生物活性
2012-3-10 閱讀(1211)
【材料和試劑】
（1） 反應(yīng)細(xì)胞：CTLL-2，存活率應(yīng)＞95%。
（2） IL-2標(biāo)準(zhǔn)品：倍比稀釋為不同濃度。
（3） 待測樣品：倍比稀釋為不同濃度。
（4） 10% Fcs-RPMI-1640*培養(yǎng)液
（5） 3H-TdR
（6） 96孔培養(yǎng)板，刻度吸管，毛細(xì)吸管，刻度離心管，離心機，加樣器（頭），細(xì)胞計數(shù)板，倒置顯微鏡，超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱，微量細(xì)胞收集儀，玻璃纖維濾紙，ß液閃計數(shù)儀。
【操作步驟】
（1） 用10 %FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌CTLL-2細(xì)胞2次，1000r/min離心5min，以去除原生長培養(yǎng)液（含IL-2）；
（2） 用10% Fcs-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/ml；
（3） 將不同倍比稀釋度的IL-2的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔，各設(shè)3復(fù)孔，同時設(shè)培養(yǎng)液對照；
（4） 各孔均加入CTLL-2細(xì)胞懸液，100μl/孔 ；
（5） 置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；
（6） 每孔均加入3H-TdR，0.5μci/孔 ，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h；
（7） 用微量細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上，用ß液閃計數(shù)儀測定各孔cpm值。測定CPM值的*時間應(yīng)是培養(yǎng)液對照（無IL-2）細(xì)胞全部或大部分死亡而加有IL-2孔細(xì)胞生長旺盛時。
【結(jié)果分析】
（1） 每孔cpm值為了復(fù)孔的平均值，再減去培養(yǎng)液對照，即為各孔zui終c
（2） 計算IL-2活性單位（參見IL-1、IL-2的MTT比色檢測法）可按下式計算：
| 樣品IL-2活性單位 （U/ml） | = | 達50%zui大增殖3H-TdR滲入值的樣品稀釋度 | × | 標(biāo)準(zhǔn)品IL-2活性單位 （U/ml） |
| 達50%zui大增殖3H-TdR滲入值的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度 |
【注意事項】
（1） 用125I-UdR代替3H-TdR進行IL-2活性檢測。其優(yōu)點是不需ß液體閃爍測定所需的試劑和設(shè)備，只需一臺小型γ計數(shù)儀即可，并可節(jié)省時間和減少ß液體閃爍操作中出現(xiàn)的誤差。其缺點是125I-UdR半衰期較短，需要定期供應(yīng)?；痉椒ㄍ?sup>3H-TdR摻入法，只是用125I-UdR代替3H-TdR，0.2μci/孔 ，然后再加入1mmol/L的5-氟尿嘧啶5μl，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞用γ計數(shù)儀測定cpm值。
（2） 其余注意事項可參見MTT法檢測IL-2活性部分。
