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上海源葉生物科技有限公司
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谷氨酸脫羧酶自身抗體1型糖尿病自身抗原
2011-11-5 閱讀(808)
1．定義 分子量為65kD和67kD的兩個(gè)異構(gòu)體GAD被稱作GAD65和GAD67，由各自的基因編碼，在氨基酸水平上有65％的同源性和80％的相似性，zui大差異位于NGAD67端110個(gè)氨基酸處（圖5-9）。酶的激活需要在C末端附近結(jié)合5，磷酸化的吡哆醛輔因子，GAD65作為脫輔基酶存在，GAD67作為結(jié)合P-5-P的全酶存在。
2．組織來源 大腦中GAD含量zui高，其次為胰島郎罕細(xì)胞，大腦垂體、性腺、腎、腎上腺和肝內(nèi)。在1型糖尿病中GAD作為一種自身抗原已被廣泛研究。在人、大鼠和小鼠的胰腺胰島中其表達(dá)形式不同，在蛋白質(zhì)水平，人胰島僅含GAD65，大鼠胰島兩種形式都存在』、鼠胰島中GAD67占絕大多數(shù)，且表達(dá)量較大鼠低。原位雜交顯示GAD65和GAD67基因表達(dá)在大鼠（可能也包括小鼠）中于胰島日細(xì)胞，而在人胰島中卻缺乏明確的定位。在mRNA水平，人胰島GAD65和GAD的比率是200；1，大鼠兩種形式都具有，小鼠中GAD67占優(yōu)勢(shì)。GAD蛋白在數(shù)代小鼠p細(xì)胞株中可檢測(cè)到，包括猿病毒40（SV40）感染的β細(xì)胞株β-TC3和pHC，于TC3細(xì)胞株表達(dá)兩種GADmRNAs，GAD65更豐富些。GAD67 mRNA在SV40轉(zhuǎn)化的非肥胖型糖尿病鼠β細(xì)胞株NIT-1表達(dá)，不表達(dá)于大鼠胰島瘤細(xì)胞株RINm5F和sr40轉(zhuǎn)化的大田鼠胰島細(xì)胞株HIT中。
3．重組GAD及抗原表位：由E。coli表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組GAD往往缺乏酶促活性，可能由于不正確的折疊造成。真核宿主（如桿狀病毒感染s{9昆蟲細(xì)胞的載體）可合成大量有酶促活性、免疫反應(yīng)性的GAD。雖然1型糖尿病血清與天然的和重組的GAD發(fā)生反應(yīng)概率相似，但在抗體結(jié)合上有差異。例如，GAD65特異性單克隆抗體可以免疫沉淀腦組織來源的GAD65和GAD67，但僅沉淀重組的GAD65。組織提取物中的異二聚體形式可引起兩種GAD的共沉淀。
在SMS和1型糖尿病中識(shí)別GAD的抗體形式明顯不同。通常，在蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡法）中，SMS患者血清中的抗體與變性的GAD反應(yīng)，而1型糖尿病患者血清中的抗體通過免疫沉淀法僅識(shí)別天然形式的GAD。另外，SMS患者的GAD抗體可與GAD65和GAD67反應(yīng)，而不到20％的1型糖尿病血清與GAD67發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，且SMS患者抗體的滴度較l型糖尿病者的高。
SMS和1型糖尿病中GAD65抗體表位的概要，GAD抗體由于存在立體構(gòu)型和分子中不同區(qū)域共同構(gòu)成，表位非常復(fù)雜。
4．純化方法 天然GAD的純化可通過凝膠過濾和DEAE-Sephadex層析或者采用GAD單克隆抗體的親和層析柱，僅需一步即可純化GAD。在桿狀病毒sr9細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的重組GAD，用陰離子交換層析或免疫親和層析純化，重組GAD由于其C末端帶有多聚組氨酸，容易通過鎳螯合物的親和層析而純化。目前已有商品化純化的GAD供應(yīng)。
