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上海源葉生物科技有限公司
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確診布氏桿菌病的免疫學(xué)方法
2011-5-25 閱讀(663)
1．試管凝集試驗(yàn)
采集臨床血清，預(yù)先稀釋，取每份預(yù)先稀釋好的4個不同稀釋度的受檢血清分別加入4個凝集試驗(yàn)管內(nèi)，每管o．5ml，加0．5ml 20倍稀釋的抗原于受檢血清各試管內(nèi)，并振搖均勻：置3；一40℃溫箱24h，取出檢查并記錄結(jié)果。牛、馬、鹿和駱駝1：100血清稀釋度，鍺、山羊、綿羊和狗1：50血清稀釋度出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時，受檢血清判定為陽性；牛、馬、鹿、駱駝1；50血清稀釋度，豬、山羊、綿羊、狗1：25血清稀釋度出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時．受檢血清判定為可疑反應(yīng)。經(jīng)3-4周后重檢，如果仍為可疑，該牛、羊判為陽性：豬和馬經(jīng)重檢仍保持可疑水平，而牲畜沒有臨床癥狀和大批陽性患畜出現(xiàn)，該畜被判為陰性；豬血清偶有非特異性反應(yīng)，須結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查判定，必要時應(yīng)配合補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和鑒別診斷。排除耶爾森菌交叉凝集反應(yīng)。
2．補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）
補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作復(fù)雜，需有良好的實(shí)驗(yàn)設(shè)施和訓(xùn)練有素的人員作準(zhǔn)確地滴定和保存試劑，盡管如此，該試驗(yàn)仍在廣泛使用，而且還是*的確診方法。指示系統(tǒng)是2．5％一3％的已用等體積兔抗綿羊紅細(xì)胞的血清（溶血素）致敏過的新鮮或以前保存的綿羊紅細(xì)胞懸液（SRBCs）。試驗(yàn)前血清要滅活，可使用96孔U形板進(jìn)行具體操作。
第1排一第3排每孔加25rtl稀釋的被檢滅活血清，第2排為每份血清的抗補(bǔ)體對照。*排各孔不加抗原，加入CFT緩沖液（抗補(bǔ)體對照）。除第2排外其他各排每孔加25ul CFT緩沖液。從第3排取稀釋血清25rtl向后連續(xù)作系列倍比稀釋。
除第1排外每孔加入25uL稀釋至工作濃度的抗原和稀釋至含所需單位的補(bǔ)體。
對照孔設(shè)置 只有稀釋液，陽性血清+補(bǔ)體+稀釋液，抗原+補(bǔ)體十稀釋液和補(bǔ)體十稀釋液。每一種對照總體積都設(shè)定為75uL。每一次試驗(yàn)中都設(shè)有能發(fā)生zui小陽性反應(yīng)的血清對照，用以檢測試驗(yàn)條件的敏感性。
微量板于37℃孵育30rain或4℃過夜，每孔加25ltl或50rtl致敏sRBC懸液，微量板于37℃再孵育30rain。
微量板在4℃條件下1000g離心10min或4℃放置2～3h，使未溶解的紅細(xì)胞下沉，溶血程度與相當(dāng)于0、25％、50％、75％和100％溶血標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比，判讀結(jié)果。第1排檢測每份血清的抗補(bǔ)體活性缺失情況。
結(jié)果解釋 當(dāng)?shù)味ńY(jié)果等于或大于20個補(bǔ)體結(jié)合單位（1CFUT）時結(jié)合補(bǔ)體呈陽性，血清判為陽性。在3-6月齡時曾用牛種布氏桿菌19株免疫過的母畜，如果在其18月齡或更大時進(jìn)行檢測，其血清滴定等于或大于301CFTU／m1則判定其為陽性。
