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nanodrop one*微量光度計(jì)技術(shù)特點(diǎn)

時(shí)間:2019/8/29閱讀:2547
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Nanodrop是實(shí)驗(yàn)室中常見的分光光度計(jì)。與傳統(tǒng)需要比色皿的分光光度計(jì)相比,Nanodrop所需樣品的體積大大減少,只需要2 μL,同時(shí)也大大降低了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備以及清洗的時(shí)間。這些優(yōu)勢使得科研人員能夠在一分鐘內(nèi)檢測多個(gè)樣品。當(dāng)然如果你有更多的樣品,還嫌效率不夠高,你可以選擇應(yīng)用Nanodrop 8000系統(tǒng),它能夠同時(shí)檢測8個(gè)樣品。

Nanodrop能夠在包括紫外及可見光區(qū)域在內(nèi)的光譜范圍內(nèi)檢測樣品的吸光度信號。在實(shí)驗(yàn)開始前,需要在儀器的軟件內(nèi)設(shè)置檢測樣品的種類,包括蛋白質(zhì),DNA, RNA等。根據(jù)吸光度,能夠計(jì)算樣品的濃度。DNA及RNA 在260 nm處有大吸收度,蛋白質(zhì)在280 nm處有大吸收峰值。濃度與吸光度的對應(yīng)關(guān)系見下表。當(dāng)然表中濃度與吸光度對應(yīng)關(guān)系成立的前提是樣品必須具有很高的純度。樣品純度可以通過A260/280判定,其臨界值可參考下表。 大家可能注意到,RNA的A260/280比值要比DNA的值高一些,這是因?yàn)閴A基U的A260/280的比值要比堿基T的A260/280比值更高。

 

吸光度

樣品

樣品濃度

高純度樣品標(biāo)準(zhǔn)(A260/280 )

A260  =1

雙鏈DNA

50 μg/ml

<1.8

單鏈DNA

33 μg/ml

單鏈RNA

40 μg/ml

>2.0

A280  = 1

蛋白質(zhì)

1 mg/ml

<0.6

對Nanodrop檢測結(jié)果產(chǎn)生直接影響的因素就是樣品的純度。A260/280是檢測樣品純度的一個(gè)指標(biāo),但這個(gè)參數(shù)只衡量了蛋白質(zhì)與核酸之間相互污染的情況。沒有考慮DNA與RNA之間彼此污染以及其他物質(zhì)污染的情況,比如苯酚在270 nm附近具有較大的吸光值。

 

因此在利用Nanodrop檢測核酸濃度的時(shí)候,除了A260/280外,A260/230也是檢測樣品純度的一個(gè)指標(biāo),高純度DNA和RNA的兩個(gè)臨界值同樣是1.8以及2.0。A260/230在2.0-2.2之間是合理的數(shù)值。對于純的核酸,A260/230的值通常大于A260/280的值。核酸提取過程中殘留的有機(jī)物通常會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。如果檢測結(jié)果顯示230nm處具有很大的吸光值,樣品很有可能被EDTA,碳水化合物或者硫氰酸胍等物質(zhì)污染了。

 

Nanodrop的檢測范圍。對于核酸來說,Nanodrop的檢測濃度范圍在2ng-15μg/μL之間。所以當(dāng)樣品的濃度很低時(shí),比如從單個(gè)或少量細(xì)胞中提取的DNA或RNA,利用Nanodrop來測量濃度可能就不適合了。這時(shí)需要考慮其他的核酸定量方法比如熒光染料的方法。

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