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上海旦鼎 流式細胞儀使用方法

時間:2019/8/24閱讀:1859
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 一.開機程序
 

  1.檢查穩(wěn)壓器電源,打開電源,穩(wěn)定5分鐘。

  2.打開儲液箱,倒掉廢液, 

  并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。打開壓力閥,取出鞘液桶,將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水,做分選必須用PBS或FACSFlow),合上壓力閥。確實蓋緊桶蓋,檢查所有管路是否妥善安置。

  3.將FACSCalibur開關(guān)打開,此時儀器功能控制鈕的顯示應是STANDBY,預熱5-10分鐘。排出過濾器內(nèi)的氣泡。

  4.如果需要打印,打開打印機電源。

  5.打開電腦,等待屏幕顯示出標準的蘋果標志。

  6.執(zhí)行儀器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的氣泡。

  7.分析樣品時,先用FACAFlow 或PBS進行HIGH RUN約2分鐘。

做過分選后,每次開機后需沖洗管道:向分選裝置上裝上兩個50ml離心管,不接通濃縮系統(tǒng),摁下右下角白色按鈕開始沖洗。待自動停止
后接通濃縮裝置,同上法沖洗一次。
 

二.預設(shè)獲取模式文件(Acquisition Template Files)
 

  1.從蘋果標志中選擇CELLQuest見一個新視窗,可利用此視窗編輯一個獲取模式文件。

  2.選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot,繪出一個或多個Dot Plots(點圖)。從Dot Plot對話框中選取Acquisition作為圖形資料來源,并確定適當?shù)膞軸和y軸參數(shù)。

  3.選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram,同上法可繪出Histogram(直方圖)。

  4.將此視窗命名后儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夾中,下次進行相同實驗時可直接調(diào)用。

本計算機中已設(shè)定兩個模式文件:ACQ和EXP,儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest  \EXP文件夾中,ACQ用于細胞DNA檢測,EXP用于細胞表面標志分析。

 
 三.用CELLQuest進行儀器的設(shè)定和調(diào)整


  1.從蘋果畫面中選取CELLQuest,進入CELLQuest后在File指令欄中打開合適的獲取模式文件。

  2.從屏幕上方Acquire指令欄中,選取Connect to Cytometer(快捷鍵: +B)進行電腦和儀器的連機。將出現(xiàn)的Acquisiton  Control對話框移至合適位置。

  3.從Cytometer指令欄中,開啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四個對話框,并將它們移至屏幕右方,以便獲取數(shù)據(jù)時隨時調(diào)整獲取條件。也可以用 +1,2,3,4獲得此四個對話框。

  4.在Detectors/Amps對話框中,先為每個參數(shù)選擇適當?shù)谋对瞿J?amplifier mode):線性模式Lin或?qū)?shù)模式Log。一般進行細胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細胞亞群時,F(xiàn)SC和SSC多以線性模式Lin測量,且DDM Param選擇FL2,而FL1,  FL2與FL3則以對數(shù)模式Log測量;分析細胞DNA含量時,F(xiàn)SC,SSC,F(xiàn)L1,F(xiàn)L2,F(xiàn)L3皆以Lin進行測量,且DDM Param選擇FL2;分析血小板表型時,F(xiàn)SC,SSC,F(xiàn)L1,F(xiàn)L2,F(xiàn)L3等均以Log進行測量。

  5.放上待檢測的樣品,將流式細胞儀設(shè)定于RUN,流速可在HIGH 或LOW上。

  6.在Acquisiton 

  Control對話框中,選取Acquire,開始獲取細胞。在以下的儀器調(diào)整過程中隨時選取Pause,Restart以觀察調(diào)整效果。未*調(diào)整好之前不要去掉SETUP前的“?”。

  7.在Detectors/Amps對話框中,調(diào)整FSC和SSC探測器中的信號倍增度:PMT voltages(粗調(diào))與Amp Gains(細調(diào)),使樣品信號出現(xiàn)在FSC-SSC點圖內(nèi),且三群細胞合理分布。

  8.在Threshold 

  對話框中選擇適當?shù)膮?shù)設(shè)定Threshold,并調(diào)整Threshold的高低,以減少噪音信號(細胞碎片)。一般做細胞表型時用FSC-H而做DNA時用FL2-H。Threshold并不影響檢測器對信號的獲取,但可改善畫面質(zhì)量。

  9.從屏幕左列繪圖工具中選取Region(區(qū)域),并在靶細胞周圍設(shè)定區(qū)域線,即通常所說的門。圈定合適的細胞群可使儀器調(diào)整更為容易。

  10.Detectors/Amps對話框中,調(diào)整熒光檢測器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根據(jù)所用的熒光陰性對照樣品調(diào)整細胞群,使之分布在正確的區(qū)域內(nèi)。

  11.在Compensation對話框中,根據(jù)所用的調(diào)補償用標準熒光樣品調(diào)整雙色(或多色)熒光染色所需的熒光補償。比如應該為FL1+ FL2- 

  的細胞群卻分布在FL1+ FL2+區(qū)域內(nèi),則需調(diào)大FL2-?%FL1中的“?”,并從FL1-FL2點圖中觀察新的調(diào)整是否恰當

  12.在Status對話框中可見:Laser Power:正常值—Run/Ready為14.7mW,Standby為5mW;Laser current:正常值為6Amps左右。

  13.調(diào)整好的儀器設(shè)定可在Instrument Settings對話框中儲存,下次進行相同實驗時可調(diào)出使用,屆時只需微調(diào)即可。

 本計算機中已有三個名叫儲存于FACStation G3 \BD Applications \CELLQuest Folder\IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files\CalibFile和Mast-Cell-Set的參數(shù)文件,前二者可用于分析人白細胞,后者用于分析小鼠肥大細胞。

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