組織細(xì)胞內(nèi)抗原的固定

組織細(xì)胞內(nèi)抗原的固定是免疫酶標(biāo)和非標(biāo)記免疫酶組織化學(xué)方法中的重要環(huán)節(jié)。經(jīng)過固定，可以達到如下目的：1.標(biāo)本在玻片上的吸著力增加；2.標(biāo)本所含的類脂和蠟質(zhì)等成分可以除去，從而有利于抗原與酶標(biāo)記抗體的結(jié)合；3.標(biāo)本的保存時間可以增長，組織切片固定后，在－20℃，可以存放一年以上而不改變免疫酶技術(shù)的染色；組織內(nèi)有關(guān)抗原不同，則所用固定劑與固定方法也隨之改變。

   丙酮和乙醇是常用的兩種固定劑。但對于許多病毒與細(xì)菌的定位研究，選擇丙酮和四氯化化碳作為固定劑是zui合適的；對于可溶性蛋白抗原的定位，常用乙醇；對于多糖，則用8%－10%福爾馬林，而不用乙醇與丙酮等有機溶劑。

   對于那些在表面覆蓋蛋白衣膜的抗原，還常用胰蛋白酶、黏蛋白酶、透明質(zhì)酸酶以及受體破壞酶進行處理。有人報道，苦味酸－甲醛固定液應(yīng)用于肝組織內(nèi)甲種胎兒蛋白酶標(biāo)定位能獲得滿意結(jié)果。

   對于植物病毒材料的固定，丙酮用得zui多，乙醇次之。因為丙酮對病毒的抗原性損害為zui小，但對于那些不穩(wěn)定的病毒，則應(yīng)避免固定。

   在應(yīng)用免疫酶技術(shù)時，固定處理對酶的活性的影響也得心中有數(shù)。許多固定劑對抗原的活性都 會有所損害，例如，福爾馬林對蛋白抗原的固定造成抗原性的破壞非常明顯。因此，對福爾馬林的使用必須嚴(yán)格控制濃度，一般使用的福爾馬林濃度為10%，盡管如此，對抗原的抗原性還是有損害，所以必須進行抗原修復(fù)。

   另外，對于堿性磷酸酶，在4℃下，丙酮固定一晝夜，能喪失30%的活性，如用丙酮固定后包埋，則喪失70%的活性；在4℃下，福爾馬林固定2－4h，則喪失25%的活性。

   固定條件對標(biāo)本的固定效果作用較大。

   固定劑濃度：丙酮zui常用的是100%；乙醇zui常用95%，但是70%乙醇的固定力為zui強；福爾馬林常用10%。

   固定的溫度：一般而言，固定作用隨溫度升高而加強，室溫是zui常用的。固定溫度可以－70－30℃。應(yīng)根據(jù)不同的抗原使用不同的溫度，麻疹病毒應(yīng)在－20－40℃用丙酮固定30min，而酶可以37℃用乙醇固定15min.

   固定液的pH：一般以所用固定劑的pH為準(zhǔn)，但若以酶去除某些抗原表面的蛋白衣膜時，應(yīng)根據(jù)所用酶的性質(zhì)調(diào)節(jié)pH。

   固定時的干濕度：干濕度一般情況下不需考慮，但某些材料在固定時受干濕度影響很大。丙酮對Hela 細(xì)胞中的灰質(zhì)炎病毒固定，在室溫干燥的情況下，N抗原就轉(zhuǎn)變?yōu)镠抗原；而在－20℃不干燥的情況下，N抗原保持不變。

   固定的時間：有長有短，一般在室溫下，固定15min左右，低溫下固定30min.如僅為了使材料不脫落為了減輕未處理的新鮮冰凍切片出現(xiàn)的空泡，則可用丙酮、乙醇和甲醛作短時間處理。

   固定后的沖洗：固定后的材料常用中性磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，以免在固定過程中可能彌散出來的物質(zhì)覆蓋表面。

   固定標(biāo)本的保存：標(biāo)本材料經(jīng)固定后，要立即使用于免疫酶技術(shù)中，不要久貯。如實在要保存，應(yīng)置于冰箱（4℃）中，在干燥的情況下24h內(nèi)抗原性損失不大。在－20℃下，冰凍切片或涂片可保存1周到1個月，石蠟切片可保存數(shù)月以上。在－20℃下保存時，為了防止形成過多的冰結(jié)晶并發(fā)生組織細(xì)胞的變化，應(yīng)將切片浸入聚乙烯醇甘油溶液中，讓其在－20℃下形成固態(tài)保護膜，然后在免疫酶染色前用手指加溫，用生理鹽水輕輕洗去，每次5min,共洗3次。這樣保存的標(biāo)本，污染增多。某些干燥標(biāo)本（例如組織內(nèi)阿米巴抗原、組織自身抗原）貯于辛烷中可長期保存（－30℃），并且?guī)缀鯚o污染。

   固定的程序很簡單，將固定劑用吸管加到標(biāo)本上去，或?qū)?biāo)本置于玻片架上浸入固定劑溶液中，固定后立即用磷酸緩沖液沖洗，然后在空氣中晾干或風(fēng)扇吹干。