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琥珀酸脫氫酶(SDH)試劑盒說明書

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琥珀酸脫氫酶(Succinate Dehydrogenase,SDH)試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

SDH(EC 1.3.5.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中。SDH是線粒體的一種標志酶,位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶,是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。

此外,為多種原核細胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。

測定原理

SDH 催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸,脫下的氫通過吩嗪二甲酯硫酸(PMS)傳遞還原2,6-

二氯酚靛酚(DCPIP),并且在600nm 處具有特征吸收峰,通過600nm吸光度的變化,測定2.6-DPIP 的還原速度,代表SDH 酶活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:100mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑二:20mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑三:1.5mL×1 支,-20℃保存;

試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存;

試劑五:粉劑×1 支,-20℃保存;

樣本的前處理

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿600g,4℃離心5min。

3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。

4、上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的SDH(此步可選做)。

5、 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎, 冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體SDH活性測定。

測定步驟和加樣表

1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至600nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

(1)在試劑四中加入18mL蒸餾水充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)水浴10min;用不完的試劑4℃保存一周;

(2)在試劑五中加入1mL蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑 4℃保存一周;

(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑五和180μL試劑四,混勻,立即記錄600nm處20s時的吸光值 A1和1min20s后的吸光值A(chǔ)2,計算ΔA=A1-A2。

SDH 活性的計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

SDH 活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T

=952×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

SDH 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

SDH 活性(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10 -4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×10 4 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

SDH 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1904×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

SDH 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

SDH 活性(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10 -4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L/mol/cm;d:96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202mL;T:反應(yīng)時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。

 

 

實驗代做服務(wù):

ELISA試劑盒免費代檢測

CCK8檢測

基因組DNA提取

 

蛋白相互作用分析

Western Blot

 

免疫組化

熒光定量PCR

動物模型服務(wù)

流式細胞檢測

細胞增殖

激光共聚焦

DNA甲基化實驗

細胞劃痕

鈣離子濃度檢測

掃描電鏡實驗

microRNA 測序

動物實驗

Taqman探針

ATP/ADP檢測

 

石蠟/冰凍切片

定點突變

線粒體膜電位(MMP)檢測

細胞生長曲線的測定

藥理毒理動物實驗

 

免疫共沉淀

真核表達載體構(gòu)建

染色質(zhì)免疫沉淀CHIP

非標定量(Label-free)實驗

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