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離心機(jī)離心分離方法

時(shí)間:2016-3-2 閱讀:3460
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高速離心機(jī)的幾種分離方法:
A.差速離心:逐次增加離心力,每次可沉降樣品溶液中的一些組份。
差速離心是一種zui常用的方法。在這種方法中,離心管在開始時(shí)裝滿了均一的樣品溶液。通過在一定速度下一定時(shí)間的離心后,就可得到兩個(gè)部份:沉淀和上清液。
通常在*次離心時(shí)把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時(shí)所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到的上清液以更高速度離心,把所需的粒子沉積下來。離心的時(shí)間要選擇得當(dāng),使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對于得到的沉淀和上清液可以進(jìn)行進(jìn)一步的離心,直到達(dá)到所需要的分離純度為止。
差速離心的特點(diǎn)是操作簡單,但分離純度不高。
B.密度梯度離心法:可以同時(shí)使樣品中幾個(gè)或全部組份分離,具有很好的分辨率。
(1)速率區(qū)帶法(ratezonal):
根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步驟如下:
在離心管中裝入密度梯度溶液,溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度)。
將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負(fù)梯度。
由于不同大小的粒子在離心力作用下,在梯度中移動(dòng)的速度不一樣,所以經(jīng)過離心后會(huì)形成幾條分開的樣品區(qū)帶。
注意:樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點(diǎn)的密度。離心過程必須在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止。
(2)等密度離心法(isopycnic):
根據(jù)粒子的不同密度來分離。離心過程中,粒子會(huì)移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶。
密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經(jīng)離心后,樣品粒子達(dá)到它們的平衡點(diǎn)。
注意:平衡后粒子的分離*由其密度決定,與時(shí)間無關(guān),此時(shí)再改變離心轉(zhuǎn)速,只能改變區(qū)帶的相對位置。
密度梯度分析法
(1)梯度介質(zhì)性質(zhì)與選擇:
A、應(yīng)具備的性質(zhì):
梯度物質(zhì)的選擇原則是滿足分離方法的基本要求,一個(gè)理想的密度材料標(biāo)準(zhǔn)它應(yīng)是:
所形成的溶液密度應(yīng)包括所需要的密度范圍。
具有某些性質(zhì),如折射率,據(jù)此可測定它的濃度。
所形成的溶液粘度低。
不損傷所分離的樣品。
離心分離后容易除去。
不妨礙分離積分的分析。
B、常用介質(zhì)種類:
表一、常用梯度材料在20℃密度
B.梯度介質(zhì)應(yīng)用范圍:
表二、等密度梯度介質(zhì)的應(yīng)用
表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度
(2)、梯度溶液的準(zhǔn)備:
計(jì)算,稀釋
(3)梯度形狀
梯度形狀分:線型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數(shù)梯度。
梯度形狀對于分離是否成功非常重要:
zui常用的是線型梯度,適用于分離蛋白質(zhì)、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒;等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品;不連續(xù)或階梯型梯度zui適用于分離整細(xì)胞、亞細(xì)胞組分以及純化一些哺乳類動(dòng)物病毒或昆蟲病毒。等速梯度以及長液柱可增進(jìn)分離能力,適用于分離核糖體亞基、多核糖體及植物病毒。
B.梯度柱制備:
梯度液柱可以用手工或梯度儀制備
半注法:
為縮減離心時(shí)間,或分離樣品較少可用半注法:下半管鋪置梯度介質(zhì),中間加樣品,上面鋪Buffer或液體石臘油。
(4)加樣方法與加樣量:
將樣品加到梯度液柱上,針尖和離心管成45-60°角度,慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去,對于DNA一類易斷的脆弱樣品,應(yīng)該用孔徑較大的移液管代替針頭,以避免剪切力對樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱zui小密度的1/10(W/W)。
(5)轉(zhuǎn)子的選擇與效應(yīng):
(6)分離區(qū)帶的回收及檢測
離心后所形成的區(qū)帶樣品的回收方法基本有四種:
a.穿刺法
穿刺離心管底部,使梯度溶液滴出,將一具有合適閥門的蓋帽放在離心管頂,可控制滴出速度。
b.虹吸法:
將一毛細(xì)管輕輕插入管底,盡量防止梯度抖動(dòng),用微量泵逐漸滴取,以一定量滴數(shù)或體積部分收取。
c.加壓法:
通過一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部,部分收集換出的溶液。
d.切割法:
采用的切割刀切割所需區(qū)帶。
區(qū)帶檢測:
所謂區(qū)帶檢測,實(shí)際上是對水平轉(zhuǎn)子或角轉(zhuǎn)子和垂直轉(zhuǎn)子離心管中的分離物質(zhì)所做的監(jiān)測,通常只是測量在260或280mm時(shí)長的吸收值,以決定梯度中的核酸或蛋白的整個(gè)分布,這個(gè)操作通常稱之為在線(online)監(jiān)測。

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