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酶免疫電泳技術(shù)

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一,酶免疫電泳技術(shù)的原理

抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí),在堿性緩沖液的條件下,抗原帶負(fù)電,向正極移動(dòng)。不同分子量或還不同電荷的抗原,在相同條件下,移動(dòng)距離不等。這些在不同部位的抗原,再與相關(guān)抗體經(jīng)擴(kuò)散形成免疫沉淀線。酶免疫電泳技術(shù)中的抗原與抗體就是酶和它的相應(yīng)抗體球蛋白。酶抗原與酶抗體形成的免疫復(fù)合物是用底物顯色的,由于酶反應(yīng)的高度靈敏性,使酶免疫電泳技術(shù)成為一項(xiàng)靈敏度高的檢測(cè)技術(shù),但僅局限于酶蛋白的分析鑒定。

二,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)免疫電泳技術(shù)的程序

1, 器材與設(shè)備

電泳儀(包括電泳槽);溫箱;載玻片(7.5cm×2.5cm);小玻棒(長(zhǎng)4cm左右,直徑約1.5mm);打孔器;鋪有濕紗布的帶蓋搪瓷盒。

2, 材料與試劑

感染病毒的植物病葉,健株葉片作對(duì)照;辣根過(guò)氧化物酶(精制)制備的兔抗酶抗體;瓊脂糖;0.1mol/pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液;底物與供氫體混合液(H2O2和DAB-4HC1)。

3,實(shí)驗(yàn)程序

(1)將小玻棒放在潔凈的載玻片中央,然后將3ml溶化的瓊脂糖溶液(0.8g瓊脂糖/100ml巴比妥鈉鹽酸緩沖液)澆制其上,待冷凝后,用針尖挑去玻棒,中央出現(xiàn)一穴槽。

(2)在穴槽一端的兩側(cè)近邊沿2mm處各打一小孔(直徑2-3mm),在一孔穴中加入健株葉片汁液,在另一孔穴加入感染病毒的植株葉片汁液。

(3)加汁液的孔穴一端接負(fù)極,電泳緩沖液仍是0.1mol/LpH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液,電壓150V,電泳1h。

(4)在穴槽加入抗HRP兔血清,置于濕盒中,在37℃溫箱中反應(yīng)3h左右或室溫過(guò)夜。

(5)在生理鹽水中浸洗3-4天,每天換水3次。

(6) 敷上干凈的濕濾紙,置于40℃烘箱內(nèi)烘干。

(7)浸入底物顯色,從沉淀弧的形狀,部位不同,比較健,病汁液所形成的沉淀線。

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