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上海一基實(shí)業(yè)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第16年

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兔基質(zhì)金屬蛋白(MMP-9)ELISA試劑盒使用說明書

時(shí)間:2010/5/24閱讀:1235
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試劑盒組成
1.         酶聯(lián)板:一塊(96孔)
2.         標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品):2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,其濃度為10 ng/mL,做系列倍比稀釋后,分別稀釋成10 ng/mL,5 ng/mL ,2.5 ng/mL,1.25 ng/mL,0.63ng/mL,0.31 ng/mL,0.15 ng/mL,其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL,臨用前15分鐘內(nèi)配制。
3.         樣品稀釋液:1×20ml/瓶。
4.         檢測(cè)稀釋液A:1×10ml/瓶。
5.         檢測(cè)稀釋液B:1×10ml/瓶。
6.         檢測(cè)溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測(cè)稀釋液A1:100稀釋。
7.         檢測(cè)溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測(cè)稀釋液B1:100稀釋。
8.         底物溶液:1×10ml/瓶。
9.         洗滌液:1×30ml/瓶,使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.     終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
標(biāo)本的采集及保存
1.細(xì)胞培養(yǎng)物上清:請(qǐng)離心后收集上清,并將標(biāo)本保存于-20℃,且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血清:標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1.         加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。除空白孔外,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品100ul,輕輕混勻,37℃,120分鐘。
2.         棄去液體,甩干,不用洗滌。
3.         每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul,37℃,60分鐘。洗板3次,350ul/每孔,甩干。
4.         每孔加檢測(cè)溶液B工作液 100ul,37℃,60分鐘,洗板5次,甩干。
5.         依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光顯色30分鐘。
6.         依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng)。用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。
1. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。
2.為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層
水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
    自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
特異性
    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的兔MMP-9,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計(jì)算
  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng)
1. 洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。
2. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
3. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。
4. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高,請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定,計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5.在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí),請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。
6.底物請(qǐng)避光保存。
說明
1.試劑盒保存:-20℃(較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí));2-8(頻繁使用時(shí))。
2.有效期:6個(gè)月
3.濃洗滌液會(huì)有鹽析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
4.中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處,請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。

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