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液相色譜使用過(guò)程中的常見問(wèn)題及解決方法

閱讀:5579      發(fā)布時(shí)間:2010-5-11
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液相色譜技術(shù),HPLC 是近期發(fā)展起來(lái)的一種具有高靈敏度、高選擇性的快速分離、分析技術(shù).它既能用于微量組分的分析測(cè)定,又能用于大量的制備分離,靈活多樣,應(yīng)用范圍已超過(guò)其它各種分離方法。如果HPLC使用人員能在分析樣品之時(shí)就熟悉常見的問(wèn)題并加以解決,就能避免許多麻煩,讓您在HPLC使用過(guò)程中輕松應(yīng)對(duì)。

1 液相色譜儀系統(tǒng)
液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱子、柱溫箱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成(見圖1)。對(duì)于整個(gè)系統(tǒng)而言,柱子、泵和檢測(cè)器是核心部件,同時(shí)也是易出問(wèn)題的主要部位。

2 常見問(wèn)題及解決方法
液相色譜儀作為一種高精密儀器,如果在使用過(guò)程中操作不當(dāng)?shù)脑?就容易導(dǎo)致一些問(wèn)題,其中zui常見的就是柱壓?jiǎn)栴}、漂移問(wèn)題、峰形異常問(wèn)題。
2.1 柱壓?jiǎn)栴}
柱壓?jiǎn)栴}是使用液相色譜過(guò)程中需要密切注意的地方,柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個(gè)恒定值,而是指壓力波動(dòng)范圍在345kPa以內(nèi)(在使用梯度洗脫時(shí),柱壓平穩(wěn)、緩慢的變化是允許的)。壓力過(guò)高、過(guò)低都屬于柱壓?jiǎn)栴}。
2.1.1 壓力過(guò)高
這是液相色譜儀在使用中zui常見的問(wèn)題,指的是壓力突然升高,一般都是由于流路中有堵塞的情況。此時(shí),我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查。
①首先斷開真空泵的入口處,此時(shí)EK管里充滿液體,使EK管低于溶劑瓶,看液體是否自由滴下,如果液體不滴或緩慢滴下,則是溶劑過(guò)濾頭堵塞。處理方法:用30%的硝酸浸泡0.5h,在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下,溶劑過(guò)濾頭正常,再檢查。②打開Purge閥,使流動(dòng)相不經(jīng)過(guò)柱子,如果壓力沒(méi)有明顯下降,則是過(guò)濾頭堵塞。處理方法:將過(guò)濾頭取出,用10%的異丙醇超聲30min。如果壓力降至690kPa以下,過(guò)濾頭正常,再檢查。③把色譜柱出口端取下,如果壓力不下降,則是柱子堵塞。處理方法:如果是緩沖鹽堵塞,則用95%的水沖至壓力正常;如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞,則要用比現(xiàn)在流動(dòng)相更強(qiáng)的流動(dòng)相沖至壓力正常。假如按上面的方法長(zhǎng)時(shí)間沖洗壓力都不下降,則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上,用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí),如果柱壓仍不下降,只有換柱子入口篩板,但一旦操作不慎,很容易造成柱效下降,所以盡量少用。
2.1.2 壓力過(guò)低
壓力過(guò)低的現(xiàn)象一般是由于系統(tǒng)泄漏,處理方法:尋找各個(gè)接口處,特別是色譜柱兩端的接口,把泄漏的地方旋緊即可。當(dāng)然還有一個(gè)原因就是泵里進(jìn)了空氣,但此時(shí)表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn),忽高忽低,更嚴(yán)重一點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致泵無(wú)法吸進(jìn)液體。處理方法:打開Purge閥,用3~5ml/min的流速?zèng)_洗,如果不行,則要用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。
2.2 漂移問(wèn)題
主要包括基線漂移和保留時(shí)間漂移。
2.2.1 基線漂移
一般說(shuō)來(lái),機(jī)器剛啟動(dòng)時(shí),基線容易漂移,大概要30min的平衡時(shí)間,如果用了緩沖溶液或緩沖鹽,還有就是在低波長(zhǎng)下(220nm)平衡時(shí)間相對(duì)會(huì)比較長(zhǎng),但如果在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)基線漂移,則要考慮下面的原因(見表1)。

2.2.2 保留時(shí)間漂移
保留時(shí)間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個(gè)重要標(biāo)志,同一種東西,兩次的保留時(shí)間相差不要超過(guò)15s,超過(guò)了30s可看做保留時(shí)間漂移,就無(wú)法進(jìn)行定性,要考慮以下原因(見表2)。

2.3 峰形異常問(wèn)題 
峰形問(wèn)題是液相的主要問(wèn)題,在做液相過(guò)程中,我們就是要變換不同的條件來(lái)改善不好的峰形,對(duì)于各種各樣的異常峰,要區(qū)別對(duì)待

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