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技術(shù)文章

大鼠TT3 ELISA KiT

閱讀:740          發(fā)布時間:2010-1-22

產(chǎn)品編號: EIA05318
使用前*閱讀說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于經(jīng)典酶聯(lián)夾心技術(shù)原理,能測量大鼠總?cè)饧紫僭彼幔═T3),只能用于研究用途,不得用于醫(yī)學(xué)診斷。

工作原理
三碘甲腺原氨酸3,5,3′-triiodothyronine 縮寫TT3,是從甲狀腺分泌出來的激素,與甲狀腺素共同在甲狀腺球蛋白分子中合成。雖表現(xiàn)與甲狀腺素相同的生理活性,但其作用比甲狀腺素強(qiáng)。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(ELISA)。預(yù)先包被的抗體為多克隆抗體。檢測相抗體也為多克隆抗體,經(jīng)生物素(biotin)標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后,PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng);經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關(guān)。

每套試劑盒中內(nèi)容(96T)
材料 數(shù)量
標(biāo)準(zhǔn)品 96T(2vial)
預(yù)包被抗體的96孔板 96T(8×12)
生物素標(biāo)記抗體 96T (1:100)
ABC(親和素-過氧化物酶復(fù)合物) 96T (1:100)
樣品稀釋液 96T×2
抗體稀釋液 96T×1
ABC稀釋液 96T×1
TMB顯色液A 96T×1
TMB顯色液B 96T×1
TMB終止液 96T×1
ELISA洗滌液 96T×1(1:25)

需要而未提供的試劑和器材
1. 37℃恒溫箱。
2. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
3. 自動洗板機(jī)。
4. 單通道或多通道可調(diào)節(jié)移液器以及其吸頭。
5. 蒸餾水,容量瓶等
6. 干凈的試管和Eppendof管。

注意事項
1. 從-20℃取出的試劑盒,在4℃解凍過夜。盒內(nèi)每一瓶解凍的溶液在開啟瓶蓋之前都要輕輕搖勻,避免解凍時出現(xiàn)的分層,否則會出現(xiàn)濃度不均一的現(xiàn)象。
2. 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
3. 配制各種試劑時,切記混勻!
4. 用戶在初次使用試劑盒時,應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,以便試劑集中到管底。
5. 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本都做雙份檢測。
6. 要嚴(yán)格避免操作過程中酶標(biāo)板干燥。干燥會使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活!
7. 為免交叉污染,要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管。

洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

樣品的準(zhǔn)備和保存
樣品如果不立即分析,應(yīng)分裝后冷凍保存,且避免反復(fù)凍融。
血清——用干凈試管收集血液,室溫凝固2小時或4℃過夜,離心1000×g 10分鐘,收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
細(xì)胞培養(yǎng)、組織勻漿、體液——離心去除沉淀,立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱文獻(xiàn)了解標(biāo)本內(nèi)待測因子的含量,決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù),以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測范圍。樣品的稀釋應(yīng)有詳細(xì)記錄。

試劑的準(zhǔn)備和保存
A. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和使用:在使用前2小時內(nèi)準(zhǔn)備。將凍干品管內(nèi)加入1ml樣品稀釋液,*溶解后做倍比稀釋。
稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品在2小時內(nèi)使用。

B.生物素標(biāo)記抗體工作液:在使用前2小時內(nèi)準(zhǔn)備。
1. 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量(實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml)。
2. 按10ul生物素標(biāo)記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

C.親和素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)工作液的準(zhǔn)備:在使用前1小時內(nèi)準(zhǔn)備。
1. 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量(實配時應(yīng)多配制0.1-0.2ml)。
2. 按10ul親和素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

D. TMB顯色工作液的準(zhǔn)備:在使用之前30分鐘,按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液。

操作程序
1. 確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目。
2. 將倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各0.1ml依次加入一排7孔中,1孔只加樣品稀釋液的作為對照。處理后的標(biāo)本按100ul每孔加入。
3. 酶標(biāo)板加上蓋,37℃反應(yīng)90分鐘。
4. 反應(yīng)后用自動洗板機(jī)吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體;或甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體,再對著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
5. 將準(zhǔn)備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)60分鐘。
6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次,每次浸泡1分鐘左右。
7. 將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)30分鐘。
8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次,每次浸泡1-2分鐘左右。
9. 按每孔0.1ml依次加入TMB顯色工作液,37℃避光反應(yīng),反應(yīng)過程中,要經(jīng)常的觀察,當(dāng)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,后3-4孔差別不明顯時,即可加入TMB終止液0.1ml/孔。(顯色反應(yīng)zui長不要超過30分鐘)。
10. 用酶標(biāo)儀在450nm測定O.D.值。
11. 根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對應(yīng)的濃度。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了N倍,其實際濃度應(yīng)該×N。

操作程序總結(jié):
準(zhǔn)備試劑,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,37℃反應(yīng)90分鐘

洗板2次,加入生物素化抗體工作液,37℃反應(yīng)60分鐘

洗板3次,加入ABC工作液,37℃反應(yīng)30分鐘

洗板5次,加入TMB顯色液,37℃反應(yīng)

加入TMB終止液

30分鐘之內(nèi)讀OD值

計算標(biāo)本待測因子含量

檢測范圍:10mmol/L→0.156 mmol/L。
敏感性: <0.055 mmol/L
特異性: 系統(tǒng)和其它因子無交叉反應(yīng)。
保存: -20℃ [短期內(nèi)(如兩周)可4℃]
有效期: 12個月(-20℃)。
用途: 用于體外定量分析液體標(biāo)本(通用型)。

 

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