化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的檢測
閱讀：1881 發(fā)布時(shí)間：2012-6-30常用的方法有Northern印跡雜交，斑點(diǎn)印跡雜交，RT-PCR，原位雜交與原位PCR，RNA半壽期的檢測，進(jìn)行中的轉(zhuǎn)錄分析（run。nassay）等。
（一）Northern印跡雜交
將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物（如尼龍膜）上，再用某一細(xì)胞因子的標(biāo)記核酸探針雜交，以檢測相應(yīng)細(xì)胞因子mRNA的分子量及其在細(xì)胞內(nèi)的積累量。
細(xì)胞因子大都是在某種刺激因素的影響下，使其mRNA轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)mRNA積累增加。但用細(xì)胞總RNA作Northern印跡雜交，其結(jié)果不能*反映mRNA的轉(zhuǎn)錄活性，因?yàn)閙RNA的穩(wěn)定性及其降解速率直接影響細(xì)胞內(nèi)mRNA的積累量。
（二）斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交
原理同上。只是用RNA替代DNA點(diǎn)樣在膜上，其變性方法與DNA不同。
（三）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）
細(xì)胞因子的mRNA壽命短且拷貝數(shù)低，因此難以在小量樣本中進(jìn)行檢測。RT-PCR是一種能檢測細(xì)胞內(nèi)低豐度特異RNA的方法，其原理是首先以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成與RNA互補(bǔ)的cDNA。然后以cDNA為模板，用PCR技術(shù)對靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，使微量細(xì)胞因子的RNA經(jīng)放大后檢出。RT-PCR能檢出單個(gè)細(xì)胞中少于10個(gè)拷貝的特異RNA，如同時(shí)放大內(nèi)參照物，即可對RT-PCR檢出的細(xì)胞因子mRNA進(jìn)行定量。
（四）原位雜交及原位RT-PCR
原位雜交的原理基本同上，僅是在組織細(xì)胞切片上，用標(biāo)記的核酸探針檢測胞漿內(nèi)的特異mRNA；而檢測細(xì)胞內(nèi)低拷貝mRNA的方法則用原位反轉(zhuǎn)錄PCR。
（五）mRNA半壽期的測定
mRNA半壽期的長短直接影響細(xì)胞內(nèi)mRNA的積累量。其測定原理是利用放線菌素D（10ug／mL）可阻斷新的mRNA的轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄停止后的不同時(shí)間提取總RNA，通過Northem印跡雜交及掃描定量，確定阻斷前已轉(zhuǎn)錄的mRNA隨著時(shí)間遷移的衰減程度，以mRNA降解到原有mRNA的50％所需要的時(shí)間為該mRNA的半壽期。