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技術(shù)文章

氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的定性鑒定

閱讀:780          發(fā)布時間:2012-6-2

一、實驗?zāi)康?/p>

(1)學(xué)習(xí)一種鑒定氨基轉(zhuǎn)移作用的簡便方法及其原理;

(2)進一步掌握紙層析的原理和操作技術(shù);

(3)了解氨基轉(zhuǎn)移作用在中間代謝中的意義。

二、實驗原理

氨基移換酶也稱轉(zhuǎn)氨酶,它能催化α-氨基酸的氨基與α-酮酸的α-酮基互換,這種作用稱為氨基移換作用。它在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與分解等中間代謝中,在糖、脂肪、蛋白質(zhì)三類物質(zhì)代謝的相互、相互轉(zhuǎn)化上,都起著很重要的作用。任何一種氨基酸進行轉(zhuǎn)氨作用時,都由其專一的轉(zhuǎn)氨酶催化。它們的zui適pH接近7.4。在各種轉(zhuǎn)氨酶中,以谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(簡稱谷草轉(zhuǎn)氨酶、GOT)及谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(簡稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶、GPT)活力zui強。

三、試劑與器材

解剖器具、離心機、恒溫水浴、干燥箱、臺秤、層析系統(tǒng)等。

1/15mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)、1%谷氨酸溶液(用KOH中和至中性)、1%丙酮酸溶液(用KOH中和至中性)、0.1%碳酸氫鉀溶液、0.05%碘乙酸溶液、15%三氯醋酸溶液、標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸溶液(0.1%)、標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸溶液(0.1%)、0.1%水合茚三酮乙醇溶液、酚溶劑。

四、操作方法

將兔擊暈,迅速解剖,取出肝臟,在低溫條件下剪碎。稱取勻漿后,離心取上清液,即為制備的酶液。體外氨基移換反應(yīng)。紙上層析法檢查每人4個點(標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸溶液、標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸溶液、對照上清液、樣品上清液)。點樣放入層析罩內(nèi)。用被酚所飽和的水溶液,平衡后,用帶小漏斗的玻璃管從層析罩上加飽合酚試劑25ml于層析缸內(nèi)。然后,立即蓋緊塞子,當(dāng)溶劑前沿達到距濾紙上端約2.5cm處,取出濾紙,晾干或吹干,以除去酚溶劑,噴灑0.1%茚三酮乙醇溶液,放入烘箱中顯色氨基酸與茚三酮反應(yīng),在濾紙上呈現(xiàn)紫紅色斑點。

五、關(guān)鍵步驟與注意事項

①取動物新鮮組織制備酶液,防止酶失活。

② 加碘乙酸抑制酶解作用。
 

 

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