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技術(shù)文章

過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶復(fù)合物的制備

閱讀:539          發(fā)布時(shí)間:2012-6-2

試劑及配制

1. HRP和兔(或羊)抗HRP:抗HRP用HRP免疫兔(或羊)獲得。

2. 0.075mol/L醋酸鈉-0.15 mol/L醋酸銨等量混合液

3. 0.1mol/LHCl和0.01mol/LHCl

4. 飽和硫酸銨溶液

5. 0.01mol/L NaOH

操作方法

1. 取兔(或羊)抗HRP血清5ml,16000r/min離心20min,去沉淀;

2. 于收集的上清中加入HRP(2mg/ml)溶液1ml,室溫緩慢攪拌1h,同上離心;

3. 沉淀物用冷生理鹽水洗滌3次,棄上清;

4. 于沉淀中加入HRP(2mg/ml)溶液4ml,混勻后,移至小燒杯;

5. 邊攪拌邊加入0.1mol/LHCl(約10滴),再用0.01mol/LHCl調(diào)pH值至2.4左右;

6. 待沉淀*溶解,溶液變清時(shí),立即加入0.01mol/LNaOH將pH值調(diào)回7.4;

7. 同上離心,去沉淀;

8. 于收集的上清中加入1/10體積的0.075mol/L醋酸鈉-0.15 mol/L醋酸銨等量混合液,混勻;

9. 在電磁攪拌下逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液,并繼續(xù)攪拌10min后,放4℃20min;

10. 同上離心,去上清,再用等量飽和硫酸銨溶液洗滌離心2次;

11. 將沉淀物溶于5ml生理鹽水,并裝入透析袋;

12. 用ph6.75醋酸鹽緩沖液(13.5L生理鹽水、1.5L蒸餾水、75ml 1.5 mol/L醋酸鈉及75ml 3mol/L醋酸銨) 4℃透析3天,每天換液2次;

13. 同上離心,取上清進(jìn)行鑒定。然后加等量60%甘油,小量分裝,-20℃保存。

注意事項(xiàng)

1. 制備PAP時(shí)應(yīng)預(yù)先選擇HRP與抗HRP的等價(jià)帶。

2. 應(yīng)用抗HRP McAb制備PAP時(shí),方法較為簡(jiǎn)單。據(jù)程明報(bào)道,用小鼠抗HRP McAb的腹水,按一定的HRP/IgG摩爾比(以4:1為宜)混合,置37℃水浴2h,即成鼠PAP復(fù)合物。而且由于抗HRP McAb與HRP形成的復(fù)合物均為可溶性的,因此不必加入過(guò)量的酶量。
 

 

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