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技術(shù)文章

白介素5(IL-5)的檢測

閱讀:1778          發(fā)布時間:2012-5-19

1.依賴細胞株增殖法 IL-5依賴株有CHl2、B13、T88-M和BCLl細胞,其培養(yǎng)條件和操作步驟與用CTLL-2細胞3H-TdR摻人法檢測IL-2類似,推薦細胞濃度和加3H-TdR前后的培養(yǎng)時間見表。

各種IL-5依賴細胞株檢測ID5的參考實驗條件
細胞株 細胞濃度 加3H-TdR前培養(yǎng)時間 加3H.TdR后培養(yǎng)時間
CHl2 5×l103/mL 48h 6h
B13 5×104/mL 36h 12h
T88-M 5×105/mL 24h 12h
BCL1 5×105/mL 72h 6h

2.DXS共刺激B細胞增殖法
(1)常規(guī)制作B細胞懸液(同IL-4檢測),使其濃度為1X106/mL,并加入10ug/mL硫酸葡聚糖(dextransulfate,DXS)。
(2)取細胞懸液100uL加入已含有IL-5待測上清的96孔板中,37℃,5%C02溫箱中培養(yǎng)60—72h。
(3)每孔加入0。5tu/20uL 3H-TdR,繼續(xù)培養(yǎng)6—8h,收集細胞后,p—液閃儀測定cpm值。IL-5含量的確定,同依賴株檢測IL-3。
3.LPS共刺激B細胞分泌IgA
(1)同上制備B細胞,調(diào)整細胞濃度至1X106/mL,并加入20Vz/mLLPS。
(2)取上述細胞懸液100ktL加入已含有IL-5待測上清的96孔板中,37℃,5%C02溫箱內(nèi)培養(yǎng)4—5d后,取無細胞上清100uL,用ELISA法檢測其中IgA含量。
4.嗜酸性粒細胞集落刺激法 操作步驟基本同前述“集落形成法”測IL-3活性。
5.過氧化氫酶檢測法 IL-5刺激嗜酸性粒細胞增殖時,嗜酸性粒細胞合成并釋放過氧化氫酶也隨之增加。因此,測定培養(yǎng)上清中過氧化氫酶的含量可反映IL-5的活性。
(1)常規(guī)制作骨髓細胞,用10%NBS-IMDM調(diào)整細胞濃度至5X106/mL。
(2)取細胞懸液100uL加入含有IL-5待測上清的96孔板中,37℃,5%C02溫箱中培養(yǎng)48h。
(3)取100uL上清,加入100ul過氧化物酶試劑,室溫作用30min,加入50uL 4m01/LH2S04終止液,于492nm測OD值。
[附]過氧化物酶試劑貯存液:①0.05mol/LTris-HCl緩沖液pH8.0;②10%三硝基甲苯X-100(4℃貯存);③20mg/mL0-鄰苯二胺(OPD)(避光);④30%U202(4℃)。
過氧化物酶試劑應用液(臨用前配制):①50mL 0.05mol/LTris-HCl緩沖液;②0.5mL10%三硝基甲苯X-100;③0.5mL20mg/mLOPD;④6uL 30%U202。

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