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淋巴母細胞增殖法檢測IL—12

閱讀:398          發(fā)布時間:2012-4-21

本法利用IL-12促進PHA激活的人淋巴母細胞增殖來測定IL-12含量,這是目前定量測定IL-12的方法,操作亦較簡單,但因IL-2、IL-4和IL-7亦可促進PHA激活的淋巴母細胞增殖,故此法不宜用于可能含多種細胞因子標本的測定。

1.用*培養(yǎng)液稀釋人或鼠IL-12標準品分別至2ng/mL和4nz/mL,然后進行5倍系列稀釋共3個稀釋度。

2.系列稀釋待檢標本,使其IL-12濃度大致處于2—20ng/mL范圍。
3.向96孔板加PHA激活的人淋巴母細胞50uL/孔(終濃度2X104/mL)。
4.加40ul待檢標本和各稀釋度IL-12標準品,設3個復孔,zui后3孔加*培養(yǎng)液50ul作為對照(無II.-12),培養(yǎng)24h。
5.加3H-TdR,繼續(xù)培養(yǎng)18h,收獲細胞,計算IL-12含量。

[附]:PHA激活的人淋巴母細胞制備:
①取正常供者外周血,常規(guī)方法分離PBMC;
②在5mL*培養(yǎng)液中懸浮PBMC,臺盼藍染色計數活細胞;
③接種于75cm2培養(yǎng)瓶,20mL液體中的細胞數為1X107,加20/uL PHA混勻后,水平培養(yǎng)3d;
④加20mL培養(yǎng)液,搖動培養(yǎng)瓶使細胞?昆勻,轉移20mL內容物至另一培養(yǎng)瓶;
⑤加人rh-IL-2至終濃度為50U/mL,孵育24h;
⑥將細胞從培養(yǎng)瓶轉移至15mL離心管,室溫下1 500r/min,離心5min,除去上清;
⑦用培養(yǎng)液同上離心洗3次,所得細胞即為淋巴母細胞。

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