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技術(shù)文章

火箭免疫電泳法測定補體C4、B因子

閱讀:822          發(fā)布時間:2012-3-3

1.主要試劑
(1)羊抗人C4抗血清:按說明書所示單擴效價擴大2—4倍稀釋,或分別用含不同濃度抗體的瓊脂糖凝膠澆板,選擇峰高、清晰度適當(dāng)?shù)目贵w濃度為zui適工作濃度。
(2)羊抗人B因子抗血清:按說明書所示單擴效價擴大3—5倍稀釋,也可按選擇C4抗血清稀釋濃度的方法確定zui適工作濃度。
(3)電泳緩沖液:稱取10.30g巴比妥鈉,1.83g巴比妥,溶于1 000mL蒸餾水中。此液為pH8.6,離子強度0.05的巴比妥緩沖液。
(4)凝膠緩沖液:以定量測定時用1:4稀釋的電泳緩沖液,B因子定量時1:5稀釋。
(5)染色液:0.25%考馬斯亮藍,稱取0.25g考馬斯亮藍R-250,溶于100mL脫色液中。
(6)脫色液:甲醇900mL、冰醋酸200mL、蒸餾水900mL。

2.操作步驟
(1)1%瓊脂糖凝膠板的制備:稱取0.50g瓊脂糖和1z聚乙二醇(PEG 6 000)置100mL三角燒瓶中,加入50mL凝膠緩沖液,隔水煮沸至瓊脂糖*溶解,55℃保溫;加入適量的抗C4血清或抗B因子血清(預(yù)先實驗選定)混勻,澆板,凝膠厚度lmm。沿陰約2cm處打孔,孔間距6~8mm,孔徑3—3.5mm。
(2)待測樣本用凝膠緩沖液1:10稀釋,參考血清對倍稀釋(一般作5個稀釋度),每孔加5~IOul。
(3)將樣本孔端接負極,電壓12。5V/cra電泳5ho
(4)取出凝膠板,用生理鹽水漂洗2次,去離子水漂洗1次。
(5)將干凈濾紙鋪在凝膠板上,干燥、常規(guī)染色、脫色。
(6)結(jié)果計算:量取各火箭峰的高度,根據(jù)峰高—濃度標準曲線計算待測樣本中C4或Bf含量。

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