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技術(shù)文章

單克隆抗體的純化

閱讀:654          發(fā)布時(shí)間:2011-8-10

大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有以下兩種。

 
    1.體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,從中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低,一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10—60ug/ml,如果大量生產(chǎn),費(fèi)用較高。小鼠可獲5一l0ml腹水。也可用注射器抽提腹水。
 
    2.體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞,制備腹水或血清。
 
    (1)實(shí)體瘤法:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按(1—3)×107/ml接種于小鼠背部皮下,每處注射o.2ml,共2~4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般10~20d)則可采血,從血清中獲得單克隆抗體的含量可達(dá)到1—10rug/m1。但采血量有限。
 
    (2)腹水的制備:常規(guī)是先腹腔注射0.5ml降植烷或液體石蠟于BALB/C鼠,1—2周后腹腔注射1X106個(gè)雜交瘤細(xì)胞,接種細(xì)胞7~10d后可產(chǎn)生腹水。密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象,待腹水盡可能多而小鼠瀕于死亡之前處死小鼠,用滴管將腹水吸人試管,一般一只可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到5—10mg/ml,這是目前zui常用的方法。還可將腹水中細(xì)胞凍存起來,復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔,則產(chǎn)生腹水快、量多。
 
    單克隆抗體的純化方法同于多克隆抗體,腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高,純化效果好。按要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目的,也有采用較簡(jiǎn)單的酸沉淀方法。目前zui有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法,多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體(zui常用Sepharose)交聯(lián),制備親和層析柱將抗體結(jié)合后洗脫,回收率可達(dá)90%以上。蛋白可與IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3結(jié)合,同時(shí)還結(jié)合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測(cè),小鼠IgG單克隆抗體溶液A280(A)為1.44吸光單位時(shí)相當(dāng)于lmg/ml。經(jīng)低pH洗脫后在收集管內(nèi)預(yù)置中和液對(duì)保持純化抗體的活性至關(guān)重要。

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