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技術(shù)文章

染色質(zhì)免疫沉淀分析(ChIP)

閱讀:958          發(fā)布時(shí)間:2011-6-15

染色質(zhì)免疫沉淀分析(ChIP)

點(diǎn)擊次數(shù):359 發(fā)布時(shí)間:2009-9-22

ChIP是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法(圖2—8),也可用于分析與轉(zhuǎn)錄、有絲分裂或DNA損傷相關(guān)的發(fā)生改變的組蛋白修飾。ChIP技術(shù)和芯片技術(shù)的結(jié)合有利于確定全基因組范圍內(nèi)染色體蛋白的分布模式以及組蛋白修飾情況。該技術(shù)主要應(yīng)用于:①組蛋白修飾研究;②轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析;③藥物開(kāi)發(fā)研究;④有絲分裂研究;⑤DNA損失與凋亡分析。ChIP是深入分析癌癥、心血管疾病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具。

 
    1.DNA剪切條件的優(yōu)化
建立打斷交聯(lián)的DNA長(zhǎng)度為200—1 000bp的實(shí)驗(yàn)條件。改變超聲時(shí)電壓設(shè)置,確保操作時(shí),樣品一直放在冰上,因?yàn)槌暜a(chǎn)生的熱量會(huì)使DNA變性,通過(guò)電泳檢測(cè)恢復(fù)交聯(lián)后的超聲DNA片段。
    2.實(shí)驗(yàn)步驟
    可采用Upstate公司的Chromatinlmmunoprecipitation(ChIPs)AssayKit進(jìn)行操作。注意:步驟(3)~(7)應(yīng)該置于冰浴中操作。
    (1)處理10C1TI培養(yǎng)皿上1X10‘細(xì)胞,確保目的基因處于轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài),同樣處理另一個(gè)10cm培養(yǎng)皿用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。
    (2)將組蛋白與DNA相互交聯(lián),加入終濃度為1%甲醛到培養(yǎng)基上,37℃孵育10min。
    (3)盡可能的吸去培養(yǎng)液,用含有蛋白酶抑制劑的冷PBS洗兩次。
    (4)將細(xì)胞刮人錐形管中。
    (5)4℃,2 000r/min離心4min。將SDS裂解液放置室溫,使SDS溶解,并加入蛋白酶抑制劑。
    (6)將細(xì)胞沉淀加入200/llSDS裂解液,冰上孵育10min(200/ul SDS裂解液是對(duì)于1X106細(xì)胞,如果有更多的細(xì)胞,要相應(yīng)增加SDS裂解液的用量)。
    (7)將DNA用超聲打斷,DNA片段長(zhǎng)度為200—1 000bp,應(yīng)在冰浴中操作,同通過(guò)優(yōu)化超聲的條件,使DNA片段長(zhǎng)度保持在200—1 000bp之間。
    (8)加人8u1 5mol/LNaCl,65℃,4h,解交聯(lián)。
    (9)通過(guò)酚—氯仿提取DNA,并用含有溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察超聲打斷DNA的效率。
    3.染色質(zhì)免疫沉淀分析
    如果超聲條件通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)得到優(yōu)化,可以在完成上述(1)一(7)步后,進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于陰性對(duì)照,可以采用非抗體免疫沉淀對(duì)照,另外也要采用非激活的樣品作為PCR部分的對(duì)照。
    (1)將所得樣品4C,13 000 r/rain離心10 min,加入200/11超聲過(guò)的細(xì)胞上清液到2ml的離心管中,棄掉沉淀。
    (2)將超聲過(guò)的細(xì)胞上清液用10倍的ChIP稀釋緩沖液稀釋。
    (3)為了減少非特異性背景,在2ml的細(xì)胞上清液中加入80ul魚(yú)精DNA/50%蛋白A瓊脂糖混合物,在4~C震蕩30min,增加孵育時(shí)間,可以進(jìn)一步減少非特異性結(jié)合。
    (4)通過(guò)短暫離心,沉淀瓊脂糖,并收集上清液部分。
    (5)加入免疫沉淀的抗體到2ml的上清液部分,在4~C震蕩孵育過(guò)夜。對(duì)于陰性對(duì)照,在上清液中加入60ul魚(yú)精DNA/50%蛋白A瓊脂糖混合物,4~C震蕩1h,繼續(xù)上述(7)步驟。
    (6)加入60ul魚(yú)精DNA/50%蛋白A瓊脂糖混合物,4~C震蕩1h,以結(jié)合抗體/組蛋白復(fù)合物。
    (7)輕微離心沉淀瓊脂糖(700—1 000r/min,4~C,1min),棄掉含有未結(jié)合的非特異性DNA,用下面的液體1m1在翻轉(zhuǎn)板上依次洗蛋白A瓊脂糖/抗體/組蛋白復(fù)合物3~5rain。
    經(jīng)過(guò)上述處理后的樣品為蛋白A瓊脂糖/抗體/組蛋白復(fù)合物,可以用于免疫共沉淀/免疫印跡或PCR分析。

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