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技術(shù)文章

熒光顯微鏡的原理部件及激發(fā)方式

閱讀:782          發(fā)布時間:2011-5-27

熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同,它不是通過普通光源的照明觀察標(biāo)本,而是利用一定波長的光(通常是紫外光、藍(lán)紫光)激發(fā)顯微鏡下標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì),使之發(fā)射熒光,所以,熒光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明,而是作為一種激發(fā)標(biāo)本的內(nèi)熒光物質(zhì)的能源。我們之所以能觀察標(biāo)本,是由于光源的照明,而是標(biāo)本內(nèi)熒光物質(zhì)吸收激發(fā)的光能后所呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。

由此可知,熒光顯微鏡的特點,主要是它的光源能供給大量特定波長范圍的激發(fā)光,使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)能獲得必要強度的激發(fā)光。同時,熒光顯微鏡必須具備相應(yīng)的濾光鏡系統(tǒng)。

熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源、濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成(圖3—12),是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。

激發(fā)熒光的方式:按光的波長范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明法)和BV激發(fā)法(使用藍(lán)紫光)兩種。UV激發(fā)法是用短于400nm的近紫外光進(jìn)行激發(fā)。該法不存在可見的激發(fā)光,所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光,容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。

BV激發(fā)法是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。該方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本,所以熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用可*阻斷藍(lán)光并可充分通過所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對于激發(fā)光的極大吸收波長和熒光的極大發(fā)光波長比較接近,所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍(lán)光作為激發(fā)光,所以熒光色素的吸收效率較高,可得到較明亮的圖像。其缺點是500nm以下的熒光無法看到,而500nm以上的使整個圖像顯黃色。在熒光抗體法中,大多以熒光色素*的顏色來判斷其特異性,所以在討論微妙的特異性時,上述BV激發(fā)法的缺點往往影響極大。

綜上所述,熒光顯微鏡的照明可根據(jù)聚光器的構(gòu)造和激發(fā)光的波長按以下三點考慮。

①從熒光像的反差要求來看,UV激發(fā)暗場聚光器照明。

②以像的亮度來考慮,BV激發(fā)濾光片暗場觀察效率zui高。

③UV激發(fā)濾光片暗場觀察和BV激發(fā)暗場聚光器照明的特性,可看作介于這兩種照明方法之間,但前者濾光片暗場的性質(zhì)較強,顯示圖像較明亮,反差?。缓笳咭虮A舭祱龉饴返男再|(zhì),故顯示圖像較暗,而反差有所改善。當(dāng)實際使用熒光顯微鏡時,應(yīng)采用標(biāo)本要求的照明法進(jìn)行觀察。

必須指出,即使像反差*的UV激發(fā)暗場聚光器照明,由標(biāo)本折射或散射的部分紫外激發(fā)光也會進(jìn)入物鏡,這樣在光學(xué)系統(tǒng)中的加拿大膠膠合面和光學(xué)玻璃因激發(fā)引起的自身熒光會使像的反應(yīng)變壞。因此,必須在目鏡前面使用紫外吸收濾光片作為截止濾光片。

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