化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
北方雜合反應(yīng)
閱讀：390 發(fā)布時間：2011-1-18北方雜合反應(yīng)的步驟主要包括：
（1） 加入核酸探針，使與固定于尼龍膜上的特定RNA 進(jìn)行雜合反應(yīng)，及
（2） 待雜合反應(yīng)結(jié)束后以含鹽緩沖液與SDS 洗掉非專一性結(jié)合于尼龍膜上的核酸探針。 進(jìn)行反應(yīng)時應(yīng)注意下列幾個問題：
（1） 實(shí)驗(yàn)操作過程仍應(yīng)盡可能避免RNase 的污染；
（2） 反應(yīng)前應(yīng)先進(jìn)行雜合前置反應(yīng)（prehybridization），以便減少核酸探針與尼龍膜的間的非專一性結(jié)合反應(yīng)；
（3） 如果所使用的核酸探針是以random priming 或PCR 等方法所制備的雙股DNA 探針，使用前務(wù)必先加熱變性；
（4） 選用適當(dāng)?shù)膰?yán)苛度 （stringency） 進(jìn)行雜合反應(yīng)及后續(xù)的轉(zhuǎn)印膜漂洗工作，以便增強(qiáng)雜合反應(yīng)訊息，并減少噪聲，這主要可以從溫度與鹽濃度兩個方面加以考量。
儀器用具：Crosslinker （Stratalinker 1800, Stratagene）；塑料盒；平端鑷子；封口機(jī)；42℃恒溫槽；60℃恒溫槽
藥品試劑：6×SSC （0.9 M NaCl, 90 mM sodium citrate）尼龍膜；Hybridization solution [formamide, 50% （v/v）; 5×SSC; blocking reagent, 2% （w/v）;N-lauroylsarcosine, 0.1% （w/v）; SDS, 0.02% （w/v）]3MM 濾紙；2×SSC, 0.1% SDS；0.1×SSC, 0.1% SDS
方法步驟：
1） RNA 轉(zhuǎn)印步驟結(jié)束后，移除電泳膠上的吸水紙與3M 濾紙。
2） 把尼龍膜連同電泳膠一齊移置于干凈衛(wèi)生紙上，并請小心維持電泳膠與尼龍膜的相對位置。
3） 以防水筆在尼龍膜上標(biāo)出電泳膠樣本孔的位置，并以剪刀剪掉尼龍膜左上角，以便標(biāo)記電泳膠的左右方位。
4） 小心地拉開尼龍膜，將的放置于6×SSC （20 mL） 浸泡5 min。
5） 以平端鑷子夾起尼龍膜，待6×SSC 滴干的后，把尼龍膜平放于衛(wèi)生紙上，風(fēng)干至少30 min。與電泳膠接觸的那一面應(yīng)朝上。
6） 以Stratalinker 1800 進(jìn)行uv 連結(jié)反應(yīng)。
7） 雜合前置反應(yīng)：
a） 將10 mL 雜合溶液注入一個塑料袋。
b） 把已經(jīng)風(fēng)干的尼龍膜移置于塑料袋內(nèi)，小心地把氣泡移除的后，以封口機(jī)密封好，再移至42℃恒溫槽進(jìn)行雜合前置反應(yīng)1~2 h。
8） 核酸探針變性反應(yīng)：
a） 以微量移液器小心地把PCR 產(chǎn)物移至新的微量離心管。
b） 將裝著核酸探針的微量離心管放入沸水中加熱10 min。請記得以夾子固定微量離心管的蓋子，以免加熱時蓋子爆開。
c） 把離心管移入冰浴里靜置3 min。
d） 瞬間離心后，取出已被變性的核酸探針，加到5 mL 的雜合溶液。
9） 雜合反應(yīng)：
a） 剪開塑料袋一角，倒出塑料袋內(nèi)雜合前置反應(yīng)所使用的溶液，并加入新配的含有核酸探針的雜合溶液 （8-d）。
b） 小心移除氣泡，并以封口機(jī)密封塑料袋。
c） 如前節(jié)所述將塑料袋移至42℃恒溫槽，雜合反應(yīng)將進(jìn)行過夜。
10） 以含鹽緩沖液與SDS漂洗轉(zhuǎn)印膜 （Northern blot）：
a） 拿出塑料袋，塑料方盒以清水沖洗干凈的后，裝入80 mL [2×SSC, 0.1%SDS]。 剪開塑料袋，把尼龍膜取出放進(jìn) [2×SSC, 0.1% SDS]，于室溫漂洗2 次，每次5 min。
b） 續(xù)以100 mL [0.1×SSC, 0.1% SDS] 于60℃洗2 次，每次15 min。溶液需先置于60℃恒溫水槽中預(yù)熱。