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技術(shù)文章

UV滅活載體噬菌體的制備

閱讀:1142          發(fā)布時(shí)間:2011-1-4
[器材和試劑]
● XL1-B1ue或者DHF’TB細(xì)胞
● f1R1噬菌體
● TB
● TBS(tris緩沖鹽水;50mmol/LTris- HCL pH 7.6 ,150mmol/L NaCl,0.05%硫柳汞)
● PEG/NaCl溶液(20%PEG,2,5mol/L NaCl)
● 皮氏培養(yǎng)皿,直徑150mm(Falcon)
● UV Stratalinker 2400(Stratagene)
● 硫柳汞(Sigma)
 
[方法]
1.用來自備存材料的或直接取自一個(gè)噬菌斑的f1Rl噬菌體,其濃度大約為109個(gè)噬菌斑形成單位(pfu), 感染2ml XLl-B1ue(Stratagene) 或者DH5。F’TB細(xì)胞。37℃靜止孵育15分鐘,再攪動(dòng)2~3小時(shí)。
2.在一個(gè)2L燒瓶中,將感染混合物稀釋到含有20ug/ml四環(huán)素的800mlTB液中。37℃孵育12-14小時(shí),劇烈搖動(dòng)(至少150r/min)。
3.用1000m1塑料瓶離心細(xì)菌/噬菌體懸液,10℃下4700r/min 60分鐘。
4.加入PEG 8000(終濃度4%)和NaCl(終濃度0.5mol/L)沉淀噬菌體。*溶解后,冰上放置4小時(shí)或4℃放置過夜。
5.4700r/min離心60分鐘。小心除去上清。以原體積1/10的TBS溶解沉淀。
6.在上清中加入1/4體積的PEG/NaCl溶液,再次沉淀噬菌體,4℃冰上孵育2小時(shí)。
7.4℃10000r/min離心噬菌體30分鐘,再用10mlTBS重懸噬菌體沉淀。
8.以8000r/min再次離心噬菌體15分鐘,然后去除不溶性部分,以pfu為單位滴定噬菌體。
9.用TBS稀釋已純化的噬菌體至大約每毫升1013個(gè)。在269nm處讀取吸光值(A269)以測量每毫升顆粒數(shù):顆粒數(shù)/m1=A269×稀釋因子× 6×1016/6407。
10.將每種稀釋比例的噬菌體溶液在各培養(yǎng)皿(直徑150mm) 中滴加20~25ul??捎米詣?dòng)分液器(比如Eppendorf 4780)操作,以節(jié)省時(shí)間并避免吸嘴污染。
11.用Stratalinker在200.000uj下,進(jìn)行2~3個(gè)照射循環(huán)。
12.收集已照射的噬菌體,加入0.05%硫柳汞,并按1m1體積分裝,4℃保存。
13.通過測量pfu檢查存活的噬菌體。噬菌體滴度應(yīng)當(dāng)?shù)陀诿亢辽?03個(gè)。

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