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技術文章

單克隆抗體細胞的選擇

閱讀:353          發(fā)布時間:2010-12-23

(一)脾細胞

    1.材料
    (1)免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠。
    (2)1640培養(yǎng)液
    (3)2.5%FCS-1640營養(yǎng)液
    2.操作方法
    (1)拉頸或用CO2處死小白鼠。
    (2)將小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在無菌條件下取脾。
    (3)把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中,冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。
    (4)用鑷子輕輕擠壓脾,做成脾細胞懸液,用毛細管將懸液移入小試管中。
    (5)直立小試管3min,使大塊的結締組織下沉,把細胞懸液移入離心管中。
    (6)以2.5%FCS—1640充滿離心管,并以400g離心7min~10min(與此同時應開始制備骨髓細胞)。
    (7)把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。
    (8)重復⑹、⑺步驟。
    (9)計算細胞,以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查,活細胞數應高于80%為合格。
   (二)骨髓瘤細胞
    骨髓瘤細胞能產生并分泌大量的免疫球蛋白,這樣的瘤細胞融合后,可能影響或降低所分泌抗體的滴度,所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞。
    選擇骨髓瘤細胞的條件:①該瘤細胞系的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品系,以便兩者的組織相容性抗原一致;②骨髓瘤細胞必須是靜息狀態(tài),不產生γ球蛋白或不分泌到細胞外;③骨髓瘤細胞生長需要一個較高的細胞密度,106個細胞/ml;④生長速度快,繁殖時間短。
    目前常用的Balb/c小鼠產生的骨髓瘤細胞株有:①S194/5XXO·BU·1;②SP2/0—Ag14(簡稱SP2);③P2—X? ­—Ag8·6·5·3(簡稱653);④FO
以653zui為常用,它是由礦物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)誘發(fā)出來的一種漿細胞瘤(Minerol Oil plasmacy toma,MOPC)并經過培育形成一株8-氮鳥嘌呤有抵抗力的亞系。
    骨髓瘤細胞一般由有關單位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,試驗時復蘇、增殖、傳代即可。
    由于骨髓瘤細胞是半貼壁狀態(tài),很容易脫落,因此不需要胰酶處理。為了防止出現返祖現象,在融合前,可將培養(yǎng)基內加入15μg/ml 8-氮鳥嘌呤。取約1×107~6×107對數生長期(即培養(yǎng)15h~20h)的骨髓瘤細胞,在室溫離心(400g)10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再懸浮并計數。
   (三)飼養(yǎng)細胞
    在體外的細胞培養(yǎng)中,單個的或數量很少的細胞不易生存與繁殖,必須加入其它活的細胞才能使其生長繁殖,加入的細胞稱之為飼養(yǎng)細胞(Feeder cell)。在細胞融合和單克隆的選擇過程中,就是在少量的或單個細胞的基礎上使其生長繁殖成群體,因此在這一過程中必須使用飼養(yǎng)細胞。許多種類的動物細胞都可以做飼養(yǎng)細胞,如正常的脾細胞、胸腺細胞、腹腔滲出細胞等,常選用腹腔滲出細胞,其中主要是巨噬細胞和淋巴細胞。應用腹腔滲出細胞的好處是:一方面做飼養(yǎng)細胞,另一方面巨噬細胞可以吞噬死亡的細胞和細胞碎片,為融合細胞的生長造成良好的環(huán)境。腹腔細胞的來源可以是與骨髓瘤細胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等。
    1.材料
   (1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只。
   (2)11.6%蔗糖溶液(經10磅30min高壓滅菌)。
    2.操作方法
   (1)拉頸處死小鼠。
   (2)70%酒精浸泡消毒10min。
   (3)用手術剪將小鼠腹部剪開一小口,剝開皮膚,露出腹腔。
   (4)用注射器將4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體,加入離心管。
   (5)1 000r/min離心10min。
   (6)取上清,以HAT選擇培養(yǎng)液將細胞制成懸液。臺盼藍染色計數活細胞,使每毫升含40萬個活細胞。
   (7)以1ml吸管將細胞種入微量培養(yǎng)皿,每孔0.05ml,含2萬個細胞,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),即可供細胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細胞數量少,則可以在細胞換液時再加入一些。

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