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技術(shù)文章

抗精子抗體(antispermatozoa antibody,ASA)檢測

閱讀:622          發(fā)布時間:2010-12-18

男性體內(nèi)的血睪屏障可使精子與免疫系統(tǒng)隔離。但當此種屏障因疾病或創(chuàng)傷而受損時,精子或其可溶性抗原逸出,可導(dǎo)致機體產(chǎn)生自身抗精子抗體(antispermatozoa antibody,ASA),從而抑制精子產(chǎn)生,造成男性不育。女性生殖道具有酶系統(tǒng),能降解進入的精子抗原,使其不能達免疫系統(tǒng)。此種酶系統(tǒng)的缺陷可使精子抗原保持完整而刺激同種抗精于抗體產(chǎn)生。大約10%~30%原因不明的女性不孕癥可能由于ASA所致。

 
    測定ASA的方法很多,目前常用的有熒光抗體法,淺盤微量凝集法,伊紅Y染色法,試管或玻片凝集法,固相酶染色法,免疫珠法,免疫洗選法(panning法)及ELISA法等。這些方法各有利弊,都不能*臨床快速診斷的要求。莊南等(1991)在ELISA反應(yīng)系統(tǒng)中,加入適量的PEG,可使每步反應(yīng)時間在10min內(nèi)完成,同時用DW-T快速沖洗代替常規(guī)的PBS-T洗滌方法,從而能在40rain內(nèi)完成檢驗。且該法有較高特異性和精密度,適用于常規(guī)工作?,F(xiàn)介紹快速ELISA法檢測抗精子抗體。
 
    1.試劑  ①人精子膜抗原:取20份正常生育男性的精液,液化后,用PBS洗5次,沉淀的精子混懸于含0.5%NP-40(FLUKA)的Tris-HCl緩沖液中,4℃1h,17 000Xg離心30min,取上清液測定蛋白量,即為精子膜抗原;②HRP標記的羊抗人丁球蛋白;③4%和8%PEG-PBST緩沖液:0.01mol/L,pH7.4PB加入NaCl達0.85%,Tween-20為0.05%及PEG6000為4%或8%。
 
    2.操作步驟  將精子膜抗原用包被液按1:100稀釋,包被反應(yīng)板微孔,每孔100uL,4℃過夜,用含0.05%Tween-20的蒸餾水(DW-T)洗3次,每孔加待測血清50uL,同時設(shè)性、陽性和空白對照孔,43℃10rain,DW-T洗3次后,加zui適工作濃度的HBP標記的抗人γ球蛋白(用含0%小牛血清的4%PEG-PBST作1:1 000稀釋),每孔100uL,43℃10min;DW—T洗3次,加底物(OPD-H202)溶液,每孔100yL,37%10min使呈色,用2mol/LH2S04 50gL終止反應(yīng),測492nm波長吸光度值(A),以P/N≥2.1為陽性。
 
  3.臨床意義  ASA的檢出率因采用的檢測方法不同,結(jié)果也不一致。通常不育者血清中ASA檢出率在10%—30%左右。尤其是梗阻性無精癥病人,ASA陽性率可高達60%。ASA的出現(xiàn)以及滴度升高是造成免疫性不育、不孕的根本原因,因而ASA的檢測對不育的臨床治療和預(yù)后的判斷提供了有價值的指標。

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