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技術(shù)文章

基因組DNA抽提

閱讀:1175          發(fā)布時間:2010-12-9

. 基因組DNA降解

(1)樣品不新鮮:雖然DNA在分子結(jié)構(gòu)上較RNA穩(wěn)定,但樣品在分離后細胞內(nèi)的DNA酶同樣會作用于DNA分子。

(2)樣品本身富含DNA酶;

2. 得率低或無基因組DNA

(1)DNA未充分釋放:在分離到的相間沉淀中加Buffer G-A后未充分振蕩釋放DNA。

(2)Buffer W2中未加入無水乙醇:未加乙醇的Buffer W2是一種低鹽溶液,可溶解DNA。若直接用于洗滌DNA-prep Tube將會溶解并去除結(jié)合在silica膜上的DNA。

(3)DNA未充分洗脫:用于洗脫DNA的Eluent或去離子水應(yīng)在使用前預(yù)熱至65℃,其體積不應(yīng)小于60 μl。

3. RNA污染

在Buffer R-C分相后分離相間沉淀的時,未將下相(含RNA)*去除。

4. 生物學(xué)活性差

(1)DNA中鹽分含量高:Buffer W1含高濃度鹽離子,后續(xù)的Buffer W2洗滌是為去除鹽分設(shè)計的。操作時按說明書的參數(shù)用Buffer W2洗滌DNA-prep Tube。

(2)DNA中含乙醇:使用前用戶已在Buffer W2中加入乙醇,若洗滌時不嚴格按照說明書提供的實驗參數(shù)進行操作可能會有乙醇殘留在silica膜上。

出現(xiàn)問題的原因分析及解決方法

可能出現(xiàn)的問題 可能原因 建議
結(jié)合柱阻塞 殘留細胞碎片 沉淀之后,確保無原材料顆粒一起被轉(zhuǎn)移。
在把試樣轉(zhuǎn)移至結(jié)合柱上時,DNA團還沒有*溶解 在加入乙醇之前,確保DNA已經(jīng)*溶解。這可能需要再次在65℃下水浴及旋渦振蕩。
樣品太黏滯 起始原料的量不要超過建議量,或者增加試劑量,并且每個樣品用2個個或以上的結(jié)合柱。
沉淀不* 沉淀后,增加離心的轉(zhuǎn)速或時間。
低DNA量 原材料沒有充分研碎 無論是干的樣品還是新鮮樣品,在加入Buffer P1之前,均要把它們制成均勻的粉粒。
組織細胞溶解不好 減少原材料的量,或增加試劑的量。
DNA仍然結(jié)合在結(jié)合柱上 把洗脫液的體積增加到200μl,并在離心之前把整個包著柱的離心管在65℃下水浴5min。
DNA被洗掉了 在洗滌之前,加入適當體積的無水乙醇以沖稀Wash Buffer的濃度。
以后的應(yīng)用中出現(xiàn)的問題 殘留鹽 Wash Buffer必須在室溫下保存。
殘留乙醇 在第二次離心洗滌后,確保結(jié)合柱在極速離心2min的情況下已經(jīng)干了。

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