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技術(shù)文章

Southern 轉(zhuǎn)印分析

閱讀:354          發(fā)布時(shí)間:2010-11-25

  在膠體中的DNA 可利用毛細(xì)現(xiàn)象的作用將DNA 牽引轉(zhuǎn)印至覆蓋在膠片上的濾膜,經(jīng)烘烤或UV 照射后,可使DNA 固定在膜上,以進(jìn)行探針的雜合(hybridization) 反應(yīng)。

 
    儀器用具:
    玻璃缸;玻璃板或吸水海綿;Crosslinker (Stratalinker 1800, Stratagene)
 
    藥品試劑:
    10×SSC (1.5 M NaCl; 0.15 M sodium citrate) 或20×SSC
    變性溶液 (1.5 M NaCl; 0.5 N NaOH)
    中和溶液 (1 M Tris-Cl; 1.5 M NaCl, pH 7.5)
    Nylon membrane 尼龍膜
    40 Methods in Biotechnology Vol 1
    Whatman 3MM 濾紙
    吸水紙
 
    方法步驟:
    1) 電泳的洋菜膠片,浸于0.25 N HCl 中15 min (當(dāng)DNA 分子量不大時(shí),可省去此步驟);以無(wú)菌水潤(rùn)洗膠片后,將膠片置于變性溶液中,于室溫緩慢震蕩15 min,更換新的變性溶液后再處理15 min。
    2) 以無(wú)菌水潤(rùn)洗膠片,再以中和溶液浸泡30 min,其間更換一次。
    3) 戴手套將尼龍膜剪裁成膠體大小,在角落剪一缺口作記號(hào)。另裁剪數(shù)張較膠片稍小的3MM 濾紙。
    4) 取一玻璃缸,加入10×SSC。將一塊長(zhǎng)形玻璃板架在缸上,裁剪一張長(zhǎng)形3MM 濾紙,寬度須略大于膠片,將濾紙置于玻璃板上,使濾紙兩端順著玻璃板垂入缸內(nèi)溶液中。加一些10×SSC 于濾紙上使其濕透,并趕掉濾紙與玻璃板間的氣泡。
?? 若有3~5 cm 厚的干凈海綿,則可取代玻璃板??蓪⒑>d置于缸中,加入10×SSC,但不可淹過海綿。海綿濕透后,其上放一張比膠片大的3MM 濾紙,要趕掉濾紙與海綿間的氣泡。
    5) 將處理過的膠片置于濾紙上,趕掉氣泡,小心將尼龍膜蓋在膠片上,不要有氣泡產(chǎn)生。 再依序蓋上兩張以10×SSC 浸濕的濾紙及兩張干的濾紙,并以保鮮膜將膠片四周封住。zui后覆蓋一迭吸水紙,上面放一塊玻璃板或塑料板,以重物壓住即可。在室溫下靜置過夜。
    6) 轉(zhuǎn)印后,小心移去重物、吸水紙、3MM 濾紙等,在尼龍膜相對(duì)于樣品槽的位置作記號(hào)。將尼龍膜掀開,與膠片接觸面朝上,置于10×SSC中緩慢震蕩5 min,以洗去附著在膜上的洋菜膠。 轉(zhuǎn)印后的膠片可再以EtBr 染色,視是否轉(zhuǎn)印*。
    7) 將尼龍膜置于干凈的濾紙上 (與膠片接觸面朝上),移至UV crosslinker中,進(jìn)行crosslinking 以將DNA 固定在膜上。
    8) 干燥后的尼龍膜即可進(jìn)行雜合。 若不立即進(jìn)行雜合,可將尼龍膜夾于兩張濾紙間,置于干燥箱中存放。

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