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生物素標(biāo)記肽的檢測(cè)方法
閱讀：1921 發(fā)布時(shí)間：2010-11-24 1．準(zhǔn)備工作
該檢測(cè)是在96孔微板上進(jìn)行，每孔均先用鏈霉親合素包被，分別依次加入待進(jìn)行表位作圖的肽系列，并用需定位的抗體檢測(cè)。
2．試劑和溶液
0．1％PBS-Tween；
2％BsA／PBS；
0．1％（wt／v01）BSA／PBS；
肽；
過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體；
TMB底物（取50／xl 50g／LTMB儲(chǔ)存液，加入5ml 0．1m01醋酸鈉，pH 6．6，另加1ul過(guò)氧化氫）；
100 btmol硫酸。
3．操作步驟
（1）干肽溶于100％DMSO中，使其貯存液的濃度為10mg／m1，工作液的終濃度為lmg／ml，貯存于—70℃。
（2）用5／Ig／m1鏈霉親和素（去離子水稀釋?zhuān)┌?6孔板每孔50pl，注意設(shè)立復(fù)孔。37℃孵育過(guò)夜。
（3）用0．1％PBS-T洗板4次，用2％BSA／PBS封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫2h。用0．1％PBS-Tween洗滌。 ．
（4）將肽用0．1％（重量／體積）BSA／PBS稀釋至終濃度為5／（g／m1（用工作原液的1／200稀釋?zhuān)?，每孔加?0txl肽溶液，濕盒置室溫孵育2h或者過(guò)夜。
（5）從孔中吸去肽，并用0．1％PBS-T洗板4次。
（6）加入待測(cè)抗體。如用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，可用原液或稀釋1／10倍（用0．1％PBS-T）稀釋。多克隆血清應(yīng)稀釋至1／200—1／2000進(jìn)行試驗(yàn)，而純化抗體應(yīng)該在1—10bg／ml。
（7）孵育2h或過(guò)夜，吸去抗體溶液，用0．1％PBS-T洗板4次。然后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（兔抗鼠IgG單克隆抗體，用5％FCS／PBS作1／1000稀釋?zhuān)覝胤跤?h。
（8）洗板4次，加入TMB底物，每孔50／J1，即50ml（50g／L）TBM儲(chǔ)備液中加入5ml醋酸鈉pH6．6及l(fā)ml過(guò)氧化氫。
（9）出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)，加入lOOmmol／L硫酸50／1l終止反應(yīng)。在450nm波長(zhǎng)下測(cè)其OD值。
在一個(gè)成功的實(shí)驗(yàn)中，一系列肽根據(jù)表位的大小以及所選擇肽的重疊程度，其中1個(gè)、2個(gè)或者3個(gè)肽可以得到強(qiáng)陽(yáng)性的信號(hào)。例如，一個(gè)長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸的肽鏈，有5個(gè)氨基酸重疊，那么，有些抗體可以與定位于5個(gè)氨基酸中的3個(gè)肽結(jié)合即產(chǎn)生強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。相反，另外一些抗體，與位于10個(gè)氨基酸表位中的2個(gè)肽結(jié)合產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)。某些抗體（極少數(shù)）僅對(duì)整條肽鏈顯示1個(gè)陽(yáng)性信號(hào)。這就意味著，氨基酸對(duì)于表位是至關(guān)重要的，常常定位于抗原的15個(gè)氨基酸區(qū)域中。
如果其他肽的背景染色很淺，可以認(rèn)為就是很好的內(nèi)在對(duì)照。一般而言，陽(yáng)性肽不加試驗(yàn)性一抗，僅加檢測(cè)試劑，應(yīng)沒(méi)有任何特異性信號(hào)。如果需要的話，表位分析可以通過(guò)氨基酸替換新的肽系列進(jìn)行試驗(yàn)，一般使用丙氨酸（alanine）進(jìn)行每一氨基酸位點(diǎn)的替換（在某些情況下，亦可以替換其他19個(gè)氨基酸）、轉(zhuǎn)位替換一段肽或者重復(fù)氨基酸片段。