無需預孵育！導入細胞質的蛋白轉染試劑             

ProteoCarry ＜Protein Transfection Reagent＞

本產品是將蛋白以及葡聚糖等生物大分子導入細胞內，尤其是導入細胞質的試劑。傳統(tǒng)的蛋白轉染試劑存在蛋白滯留在內體或溶酶體中的問題，但是由于本產品可以高效地將蛋白運送至細胞質，可以廣泛地適用于在評價導入蛋白的細胞內功能和抗體導入引起的功能抑制誘導等的實驗。另外與傳統(tǒng)產品不同的是，本品無需與蛋白進行預孵育，所以不會形成復合體，低限度地限制其對蛋白功能的影響。

※本產品僅供研究，研究以外請勿使用。

◆蛋白轉染試劑及其問題

蛋白轉染試劑（Proteofection試劑）是將重組蛋白和抗體直接導入細胞的工具。與將質粒導入以誘導表達目的蛋白的方法相比，可以更迅速地導入目的蛋白，因而受到了廣泛地關注。

雖然已經開發(fā)了許多基于肽、陽離子的脂質或聚合物的蛋白轉染試劑，但它們都是與蛋白形成復合物后，通過胞吞作用攝入細胞內，破壞內體膜將其運送至細胞質。然而，現(xiàn)有的大部分試劑內體膜的破壞活性低，并且從內體逃脫不足，導入的蛋白大部分都轉移至溶酶體降解系統(tǒng)。本產品是一種新型肽蛋白轉染試劑，克服了傳統(tǒng)的蛋白轉染試劑的缺點，通過強有力的內體膜選擇性破壞活性，高效地向細胞質運送蛋白，使轉導的蛋白在細胞內發(fā)揮活性。另外，與傳統(tǒng)的蛋白轉染試劑不同，本品無需與蛋白的復合物，不僅僅是蛋白，還可以向細胞質導入生物大分子（葡聚糖等）。

圖1.　細胞導入原理的比較

圖2是導入熒光標記IgG的案例。不添加轉染試劑時，以內體/溶酶體的染色為主，從細胞質中無法獲得熒光信號，與之相對的，可以觀察到在本產品案例中，內體、細胞質被大面積染色。（詳情請參照應用實例）

圖2.　向HeLa細胞導入熒光標記IgG的比較

◆特點

●　基于肽特性的蛋白轉染試劑，顯示出高度水溶性。

●　優(yōu)異的內體膜破壞活性，與傳統(tǒng)方法相比顯示出高細胞質傳達性。

●　無需與導入物質進行預孵育，可以簡便且迅速地轉染。

●　由于不會與蛋白形成復合物，所以需要添加濃度較高的蛋白，但是可以低限度地抑制對蛋白功能的影響。

●　只需要1小時的處理就可以充分地轉染至細胞質。

●　有無血清（<10% FBS）不會影響導入效率，可以根據(jù)想要使用的細胞設計實驗。

●　已有向細胞質導入各種蛋白及生物大分子的應用實例。

●　例：IgG抗體、功能性蛋白（Cre recombinase, Saponin）、多糖（葡聚糖）

●　推薦使用濃度幾乎沒有細胞毒性。

◆使用方法概述

1.　向新鮮的培養(yǎng)基（無血清培養(yǎng)基，10%以下含F(xiàn)BS培養(yǎng)基或PBS）添加本產品以及想要導入的蛋白。

1.　（配制轉染混合液）。

1.　※無需預孵育

2.　用PBS清洗2次細胞（80%以下的融合狀態(tài)）后，向細胞添加轉染混合液。

3.　在轉染混合液中培養(yǎng)細胞（~1h）

4.　用PBS清洗2次細胞后，添加新鮮的培養(yǎng)基。

5.　實現(xiàn)各項應用。

◆試劑盒組成

●　ProteoCarry（4 mg）

●　FITC-dextran（2 mg，陽性對照用）

實驗次數(shù)的預測

◆有導入數(shù)據(jù)的細胞

HeLa, SW280, COS7, NIH3T3, HUVEC

參考導入量

※導入效率根據(jù)細胞類型，細胞數(shù)量和蛋白類型各種因素改變。以上數(shù)據(jù)僅供參考，建議每次實驗都要優(yōu)化數(shù)據(jù)。

◆應用實例

1.　向細胞內導入FITC-dextran

向HeLa細胞導入FITC-Dextran（培養(yǎng)基的終濃度為200 μg/mL），僅向細胞添加FITC-Dextran時，（Reagent(-)）觀察到點狀的熒光信號，細胞質中幾乎沒有觀察到信號；相反，使用本產品時擴散到了整個細胞質。

實驗概要：

向HeLa細胞（80% confluent）添加200 μg/mL FITC-dextran, 1×ProteoCarry in α-MEM，并培養(yǎng)1個小時。用PBS清洗細胞后，進行核染色（Hoechst）。

2.　向細胞內導入熒光標記IgG

向HeLa細胞導入熒光標記IgG抗體（培養(yǎng)基終濃度為250 μg/mL），僅有抗體添加至細胞時，可以觀察到胞吞作用自發(fā)性攝入點狀的熒光信號，表明抗體停留在內體和溶酶體中。另一方面，使用本產品時，不僅能觀察到點狀的內體結構，還可以觀察到它主要在細胞質中廣泛擴散。

※用熒光信號觀察細胞擴散時，與內體相比，由于細胞質的體積較大，信號會被稀釋。細胞質信號的檢測需要添加高濃度的熒光標記蛋白，在本數(shù)據(jù)中添加了250 μg/mL的熒光標記IgG。

實驗概要：

向HeLa細胞（80% confluent）添加250 μg/mL熒光標記IgG，1×ProteoCarry in α-MEM并培養(yǎng)1小時。用PBS清洗細胞后，進行核染色（Hoechst）。

3.　向細胞內導入Cre recombinase

將設計為Cre recombinase不存在時表達DsRed，只有在Cre recombinase存在時發(fā)生重組表達GFP的質粒向HeLa細胞導入基因。相對于導入第二天就表達DsRed的HeLa細胞，使用本產品導入Cre recombinase（培養(yǎng)基終濃度為10 μM），依賴導入細胞內的Cre recombinase表達GFP，本產品在維持Cre recombinase的功能下將其導入了細胞。

實驗概要：

向HeLa細胞轉染質粒的第二天，向HeLa細胞添加10 μM Cre recombinase, 1×ProteoCarry in α-MEM，并培養(yǎng)1小時。用PBS清洗細胞后，用新的培養(yǎng)基再培養(yǎng)24小時。

◆保存

●　運輸：室溫

●　保存：-20℃

◆產品列表